背景技術：

1、大規(guī)模平行深度測序也被稱為下一代測序(ngs)，其使得進行大規(guī)模dna和rna測序成為可能。這些方法涉及大規(guī)模核酸序列的平行多重分析，從而允許來自單獨鏈的數(shù)百萬至數(shù)十億個序列被分別但同時分析。

2、多重分析可能是具有挑戰(zhàn)性的，因為通常待分析的不同樣品中存在的核酸的量不同，這可能產(chǎn)生低濃度樣品測序不足而高濃度樣品測序過度的不準確性。因此，已經(jīng)采用了用于使樣品之間的核酸濃度歸一化的各種方法。已經(jīng)使用分光光度法、電泳法、熒光測定法和定量pcr(qpcr)來檢測樣品中核酸的濃度，以便使樣品之間的濃度歸一化。這些方法中的每種方法都具有缺點，如通過進行手動調整引入的不準確性、缺乏靈敏性和涉及大量時間和/或費用的多個步驟。

技術實現(xiàn)思路

1、在一些方面，本公開描述了用于使兩個或更多個多核苷酸測序文庫之間的多核苷酸濃度歸一化的方法和組合物。用于測序(例如，下一代測序(ngs))的多核苷酸制備通常涉及將銜接子多核苷酸序列添加到所述多核苷酸中。某些技術(如illumina測序)使用銜接子序列對多核苷酸進行測序。本文認識到，可以利用這些銜接子序列來使不同多核苷酸測序文庫之間的多核苷酸濃度歸一化。具體來說，認識到多核苷酸測序文庫歸一化可以通過以下方式來實現(xiàn)：使多核苷酸測序文庫與預定量的核糖核蛋白(例如，催化失活的crispr相關蛋白(dcas)-向導rna(grna)復合物)接觸，所述核糖核蛋白與多核苷酸文庫的銜接子序列結合，并且提取(1)包含銜接子且(2)被所述核糖核蛋白復合物結合的多核苷酸。證明了對多個不同的多核苷酸測序文庫使用該方法使多核苷酸測序文庫之間的多核苷酸濃度歸一化。

2、因此，在一些方面，本公開提供了用于使至少兩個樣品之間的靶多核苷酸的濃度歸一化的方法，所述至少兩個樣品各自包含靶多核苷酸，對于所述至少兩個樣品中的每個樣品，所述方法包括：

3、(i)獲得所述樣品，其中所述樣品的所述靶多核苷酸包含銜接子序列；

4、(ii)產(chǎn)生溶液，所述產(chǎn)生包括合并(a)所述樣品，(b)預定濃度的向導多核苷酸，所述向導多核苷酸包含與所述樣品的所述靶多核苷酸的所述銜接子序列互補的靶向區(qū)；和(c)預定濃度的dcas或dargonaute，所述dcas或所述dargonaute包含親和標簽，其中所述預定濃度的所述dcas或所述dargonaute與所述向導多核苷酸同源；

5、(iii)使所述溶液與固相接觸，所述固相包含能夠與所述親和標簽結合的親和標簽結合分子；

6、(iv)將所述溶液與所述固相分離；以及

7、(v)從所述固相中提取所述靶多核苷酸，以使所述兩個或更多個樣品之間的靶多核苷酸的濃度歸一化。在一些實施方式中，所述靶向區(qū)與銜接子序列的靜態(tài)區(qū)互補。在一些實施方式中，所述向導多核苷酸包含crispr相關蛋白(cas)向導rna(grna)多核苷酸或argonaute向導多核苷酸。在一些實施方式中，所述靜態(tài)區(qū)是下一代測序銜接子序列的靜態(tài)區(qū)。在一些實施方式中，所述靶向區(qū)與seq?id?no:27-36中任一所示的銜接子序列互補。在一些實施方式中，所述靶向區(qū)與seq?id?no:27-28中任一所示的銜接子序列互補。在一些實施方式中，所述靶向區(qū)與seq?id?no:29-30中任一所示的銜接子序列互補。在一些實施方式中，所述靶向區(qū)與seq?id?no:31-32中任一所示的銜接子序列互補。在一些實施方式中，所述靶向區(qū)與seq?id?no:33-34中任一所示的銜接子序列互補。在一些實施方式中，所述靶向區(qū)與seq?id?no:35所示的銜接子序列互補。在一些實施方式中，所述靶向區(qū)與seq?id?no:36所示的銜接子序列互補。

8、在一些實施方式中，所述cas?grna多核苷酸靶向區(qū)是同源區(qū)。在一些實施方式中，所述cas?grna多核苷酸包含seq?id?no:1-26中任一所示的同源區(qū)。在一些實施方式中，所述cas?grna多核苷酸包含seq?id?no:1所示的同源區(qū)。

9、在一些實施方式中，所述argonaute向導多核苷酸是sirna、mirna、pirna、shrna或sidna。

10、在一些實施方式中，所述向導多核苷酸是dna多核苷酸。在一些實施方式中，所述向導多核苷酸是rna多核苷酸。在一些實施方式中，所述向導多核苷酸包含經(jīng)修飾的核酸。在一些實施方式中，所述經(jīng)修飾的核酸包含2'f?rna、2'ome?rna和/或硫代磷酸酯鍵(ps)。

11、在一些實施方式中，所述向導多核苷酸是cas?grna多核苷酸，并且所述cas?grna多核苷酸在與cas蛋白相互作用的位置不包含經(jīng)修飾的核酸，所述cas蛋白和所述grna同源。在一些實施方式中，所述dcas是催化失活的cpf1、c2c1、c2c3、c2c2、casx或casy蛋白。在一些實施方式中，所述dcas蛋白包含seq?id?no:37的氨基酸序列。

12、在一些實施方式中，所述dargonaute是催化失活的lrago、pfago、ttago、aaago、afago、mjago、mpago、ngago、rsago、cpago、ibago、kmago或seago。

13、在一些實施方式中，所述親和標簽結合分子包含ni2+并且所述親和標簽包含his標簽。

14、在一些實施方式中，所述親和標簽結合分子包含生物素并且所述親和標簽包含親和素。在一些實施方式中，所述親和標簽結合分子包含抗myc抗體并且所述親和標簽包含myc標簽。在一些實施方式中，所述親和標簽和對應的親和標簽結合分子選自表1。

15、在一些實施方式中，所述固相包含磁珠。在一些實施方式中，將所述溶液與所述固相分離包括固定所述固相并洗滌所述固相。在一些實施方式中，從所述固相中提取所述靶多核苷酸包括合并所述固相和蛋白酶。在一些實施方式中，從所述固相中提取所述靶多核苷酸包括在足以產(chǎn)生蛋白酶k活性的溶液中合并所述固相和蛋白酶k。在一些實施方式中，蛋白酶k消化與所述固相結合的所述dcas或dargonaute，由此提取所述靶多核苷酸。

16、在一些實施方式中，步驟(i)-(v)是按先后順序進行的。

17、在一些實施方式中，歸一化包括使所述至少兩個樣品之間的靶多核苷酸的濃度在歸一化之后在彼此的15％之內(nèi)。

18、在一些方面，本公開提供了一種用于使至少兩個樣品之間的靶多核苷酸的濃度歸一化的方法，所述至少兩個樣品各自包含靶多核苷酸，對于所述至少兩個樣品中的每個樣品，所述方法包括：

19、(i)獲得所述樣品，其中所述樣品的所述靶多核苷酸包含銜接子序列；

20、(ii)產(chǎn)生溶液，所述產(chǎn)生包括合并(a)所述樣品，(b)預定濃度的向導多核苷酸，所述向導多核苷酸包含與所述樣品的所述靶多核苷酸的所述銜接子序列互補的靶向區(qū)，和(c)預定濃度的dcas或dargonaute，所述dcas或所述dargonaute包含親和標簽；以及

21、(iii)使所述溶液與預定量的有催化活性的cas或argonaute蛋白接觸，以使所述兩個或更多個樣品之間的靶多核苷酸的濃度歸一化。

22、在一些實施方式中，所述dcas是催化失活的cpf1、c2c1、c2c3、c2c2、casx、cas9或casy蛋白。在一些實施方式中，所述dcas蛋白包含與seq?id?no:37具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述dcas蛋白包含seq?id?no:37的氨基酸序列。

23、在一些實施方式中，所述dargonaute是催化失活的lrago、pfago、ttago、aaago、afago、mjago、mpago、ngago、rsago、cpago、ibago、kmago或seago。

24、在一些實施方式中，步驟(ii)包括dcas或dargonaute與所述靶多核苷酸中的至少一些靶多核苷酸的所述銜接子序列的結合。在一些實施方式中，所述有催化活性的cas9或argonaute消化未被所述dcas9或所述dargonaute結合的靶多核苷酸。在一些實施方式中，歸一化包括使所述至少兩個樣品之間的靶多核苷酸的濃度在歸一化之后在彼此的15％之內(nèi)。在一些實施方式中，歸一化包括使所述至少兩個樣品之間的靶多核苷酸的濃度在歸一化之后在彼此的10％之內(nèi)。在一些實施方式中，所述靶多核苷酸包含第一銜接子序列和第二銜接子序列，并且其中所述向導多核苷酸靶向區(qū)與所述第一銜接子序列互補。

25、在一些實施方式中，所述方法進一步包括，在步驟(i)之后且在步驟(ii)之前進行以下操作：

26、(a)使所述樣品與編碼與所述第二銜接子序列的一部分互補的核酸序列的引物接觸，其中所述銜接子序列的所述部分位于所述銜接子序列的近端部分；以及

27、(b)使所述樣品與dna聚合酶在足以促進引物延伸的條件下接觸。

28、在一些實施方式中，所述銜接子序列的所述部分包含seq?id?no:28、30、32和34中的任一者的核酸序列。

29、在一些實施方式中，所述第二銜接子序列是3'銜接子序列。在一些實施方式中，所述第二銜接子序列是5'銜接子序列。

30、在一些方面，本公開提供了一種向導多核苷酸，所述向導多核苷酸包含靶向區(qū)，所述靶向區(qū)與seq?id?no:28和30、32、34-36中任一所示的銜接子序列互補。在一些實施方式中，所述向導多核苷酸包含crispr相關蛋白(cas)向導rna(grna)多核苷酸或argonaute向導多核苷酸。

31、在一些實施方式中，所述靜態(tài)區(qū)是下一代測序銜接子序列的靜態(tài)區(qū)。在一些實施方式中，所述靶向區(qū)與seq?id?no:28所示的銜接子序列互補。在一些實施方式中，所述靶向區(qū)與seq?id?no:30所示的銜接子序列互補。在一些實施方式中，所述靶向區(qū)與seq?id?no:32所示的銜接子序列互補。在一些實施方式中，所述靶向區(qū)與seq?id?no:34所示的銜接子序列互補。在一些實施方式中，所述靶向區(qū)與seq?id?no:35所示的銜接子序列互補。在一些實施方式中，所述靶向區(qū)與seq?id?no:36所示的銜接子序列互補。

32、在一些實施方式中，所述cas?grna多核苷酸靶向區(qū)是同源區(qū)。在一些實施方式中，所述cas?grna多核苷酸包含seq?id?no:1-26中任一所示的同源區(qū)。在一些實施方式中，所述cas?grna多核苷酸包含seq?id?no:1所示的同源區(qū)。

33、在一些實施方式中，所述argonaute向導多核苷酸是sirna、mirna、pirna、shrna或sidna。

34、在一些實施方式中，所述向導多核苷酸是dna多核苷酸。在一些實施方式中，所述向導多核苷酸是rna多核苷酸。在一些實施方式中，所述向導多核苷酸包含經(jīng)修飾的核酸。在一些實施方式中，所述經(jīng)修飾的核酸包含2'f?rna、2'ome?rna和/或硫代磷酸酯鍵(ps)。在一些實施方式中，所述向導多核苷酸是cas?grna多核苷酸，并且所述cas?grna多核苷酸在與cas蛋白相互作用的位置不包含經(jīng)修飾的核酸，所述cas蛋白和所述grna同源。

35、在一些實施方式中，本公開在本文中提供了一種試劑盒，所述試劑盒包含(a)本文所述的向導多核苷酸，和(b)cas蛋白或argonaute蛋白、或編碼cas蛋白或argonaute蛋白的多核苷酸序列。在一些實施方式中，所述cas蛋白是催化失活的cas蛋白(dcas)。在一些實施方式中，所述cas蛋白是催化失活的cas9蛋白(dcas9)。在一些實施方式中，所述cas9蛋白包含d10a突變和h840a突變。在一些實施方式中，所述cas蛋白是催化失活的cpf1、c2c1、c2c3、c2c2、casx或casy蛋白。在一些實施方式中，所述dcas蛋白包含與seq?id?no:37具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述dcas蛋白包含seq?id?no:37的氨基酸序列。

36、在一些實施方式中，所述argonaute蛋白是催化失活的(dargonaute)。在一些實施方式中，所述argonaute蛋白是催化失活的cbago蛋白。在一些實施方式中，所述argonaute蛋白是催化失活的lrago、pfago、ttago、aaago、afago、mjago、mpago、ngago、rsago、cpago、ibago、kmago或seago蛋白。在一些實施方式中，所述dargonaute蛋白包含與seq?id?no:39-45中的任一者具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述dargonaute蛋白包含seq?id?no:39-45中的任一者的氨基酸序列。

37、在一些實施方式中，所述試劑盒進一步包含有催化活性的cas蛋白或有催化活性的argonaute蛋白。在一些實施方式中，所述有催化活性的cas蛋白包含cpf1、c2c1、c2c3、c2c2、casx、cas9或casy。在一些實施方式中，所述有催化活性的argonaute蛋白包含lrago、pfago、ttago、aaago、afago、mjago、mpago、ngago、rsago、cpago、ibago、kmago或seago。在一些實施方式中，所述向導多核苷酸能夠與所述cas蛋白或所述argonaute蛋白結合以形成核糖核蛋白復合物，并且所述核糖核蛋白復合物能夠與銜接子序列結合。

38、在一些實施方式中，所述試劑盒進一步包含與銜接子序列的一部分互補的引物。在一些實施方式中，所述銜接子序列的所述部分位于所述銜接子序列的近端部分中。在一些實施方式中，所述銜接子序列的所述部分位于所述銜接子序列的所述近端部分中，所述銜接子序列包含seq?id?no:28、30、32和34中的任一者的核酸序列。在一些實施方式中，所述銜接子序列是3'銜接子序列。在一些實施方式中，所述銜接子序列是5'銜接子序列。在一些實施方式中，所述引物不與銜接子序列互補，所述銜接子序列和所述向導多核苷酸靶向區(qū)互補。

39、在一些方面，本公開提供了一種反應混合物，所述反應混合物包含：(i)多個靶多核苷酸，其中所述靶多核苷酸包含seq?id?no:28、30、32和34-36中任一所示的銜接子序列；(ii)預定濃度的向導多核苷酸，所述向導多核苷酸包含與所述銜接子序列互補的靶向區(qū)；以及(iii)預定濃度的dcas蛋白或dargonaute蛋白。

40、在一些實施方式中，所述向導多核苷酸或所述dcas蛋白或所述dargonaute蛋白的所述預定濃度低于所述反應混合物中靶多核苷酸的濃度。

41、在一些實施方式中，所述dargonaute蛋白包含lrago、pfago、ttago、aaago、afago、mjago、mpago、ngago、rsago、cpago、ibago、kmago或seago或其催化失活的變體，并且所述向導多核苷酸與所述dargonaute蛋白同源。在一些實施方式中，所述dcas蛋白包含催化失活的cpf1、c2c1、c2c3、c2c2、casx、cas9或casy或其變體，并且所述向導多核苷酸與所述dcas蛋白同源。在一些實施方式中，所述銜接子序列包含seq?id?no:28、30、32和34-36中的任一者的多核苷酸序列。在一些實施方式中，所述反應混合物進一步包含催化活性的cas蛋白或催化活性的argonaute蛋白。

42、在一些實施方式中，本公開提供了一種核糖核蛋白(rnp)復合物，所述rnp復合物包含：(i)本文所述的向導多核苷酸；(ii)cas蛋白或argonaute蛋白，所述cas蛋白或所述argonaute蛋白與所述向導多核苷酸同源；以及(iii)銜接子序列，其中所述向導多核苷酸的靶向區(qū)與所述銜接子序列互補，并且其中所述向導多核苷酸與所述cas蛋白或所述argonaute蛋白同源。在一些實施方式中，所述argonaute蛋白包含lrago、pfago、ttago、aaago、afago、mjago、mpago、ngago、rsago、cpago、ibago、kmago或seago或其催化失活的變體。在一些實施方式中，所述cas蛋白包含cpf1、c2c1、c2c3、c2c2、casx、cas9或casy或其催化失活的變體。在一些實施方式中，所述銜接子序列包含seq?id?no:28、30、32和34-36中的任一者的多核苷酸序列。