本發(fā)明屬于分子生物技術(shù)和分子標(biāo)記，具體涉及一種與豬乳頭數(shù)和背膘厚相關(guān)的snp分子標(biāo)記及其應(yīng)用，該snp分子標(biāo)記的純合突變tt基因型個體乳頭數(shù)性狀顯著高于cc基因型，tt基因型個體背膘厚更薄。

背景技術(shù)：

1、在種豬選育體系中，總?cè)轭^數(shù)是決定生產(chǎn)效益的關(guān)鍵指標(biāo)，其中總?cè)轭^數(shù)直接決定了母豬哺乳效率與仔豬存活率，有效乳頭數(shù)不足會導(dǎo)致仔豬哺乳期激烈競爭，引發(fā)仔豬死亡率上升[1]。今后，總?cè)轭^數(shù)性狀的改良將受到更加重視，成為育種工作的重要方向之一。通過培育出總?cè)轭^數(shù)更多的豬種，能夠有效地提高斷奶仔豬存活率，從而為生豬養(yǎng)殖企業(yè)提供更高的生產(chǎn)效益和經(jīng)濟(jì)效益，推動養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)向更加健康和可持續(xù)發(fā)展。以分子育種為核心的種豬遺傳改良，會成為生豬養(yǎng)殖業(yè)的剛性需求。

2、當(dāng)前種豬遺傳改良仍面臨多重瓶頸，傳統(tǒng)表型選擇依賴人工測量乳頭數(shù)，存在效率低、誤差大、選育周期長等問題，乳頭數(shù)作為中等遺傳力性狀，表型選擇遺傳進(jìn)展緩慢[2]。類似問題也存在于其他重要經(jīng)濟(jì)性狀的選育中。例如，活體背膘厚作為衡量種豬脂肪沉積能力的關(guān)鍵指標(biāo)，其表型測定依賴超聲波或探針穿刺法，雖較乳頭數(shù)測量更易實(shí)施，但仍存在顯著局限性?；铙w背膘厚在實(shí)際生產(chǎn)中測量值檢測結(jié)果易受操作人員技能、設(shè)備精度及豬體保定狀態(tài)的影響。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記輔助選擇(marker-assisted?selection,mas)已成為傳統(tǒng)育種方法的重要補(bǔ)充手段。該技術(shù)通過識別核苷酸層面的個體基因型差異，能夠突破傳統(tǒng)選育的局限性，特別在遺傳力偏低或活體難以直接觀測的性狀改良中展現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢。目前，mas技術(shù)已在動物遺傳改良領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)規(guī)?；瘧?yīng)用，推動育種體系邁入精準(zhǔn)化時代?？v觀動物育種發(fā)展歷程，其技術(shù)迭代可分為三大階段：早期基于表型觀測的經(jīng)驗(yàn)性選擇、中期結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)模型的育種值評估，直至當(dāng)前以基因組信息為核心的分子設(shè)計(jì)育種。在此進(jìn)程中，單核苷酸多態(tài)性(single?nucleotidepolymorphism,snp)標(biāo)記技術(shù)的突破具有里程碑意義,這是由單個堿基變異引發(fā)的dna序列多態(tài)性,包括轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失四種類型，為從分子層面解析復(fù)雜性狀遺傳機(jī)制提供了全新視角[3]。作為基因組遺傳多樣性的重要來源，snp廣泛分布于編碼區(qū)與非編碼區(qū)：位于基因編碼區(qū)的snp可能通過改變氨基酸序列影響蛋白質(zhì)功能；而在調(diào)控區(qū)域的snp則可通過修飾轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、干擾非編碼rna作用或引發(fā)表觀遺傳改變等途徑調(diào)控基因表達(dá)[4]。這種多層次的作用機(jī)制使得snp標(biāo)記成為加速豬重要經(jīng)濟(jì)性狀遺傳改良的核心工具。

3、全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide?association?study,gwas)是一種重要的現(xiàn)代育種技術(shù)，通過分析動物基因組的單核苷酸多態(tài)性,篩選出和經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的候選基因[5]。全基因組關(guān)聯(lián)分析憑借群體水平的高密度標(biāo)記覆蓋和高效算法模型，能夠在全基因組范圍內(nèi)精準(zhǔn)捕捉與乳頭數(shù)性狀顯著相關(guān)的功能性變異位點(diǎn)。全基因組關(guān)聯(lián)分析技術(shù)的出現(xiàn)，可以在動物基因組上精確地標(biāo)記出影響重要經(jīng)濟(jì)性狀的特定位點(diǎn)，提高育種效率。

4、對核心群大白豬品種乳頭數(shù)進(jìn)行改良，提高總?cè)轭^數(shù)，從而提高斷奶仔豬的存活率，增強(qiáng)生豬養(yǎng)殖業(yè)的生產(chǎn)競爭力；對核心群大白豬品種背膘厚性狀進(jìn)行改良，能夠提高商品豬產(chǎn)肉效率，增強(qiáng)商品豬生產(chǎn)的競爭力，提高商品豬養(yǎng)殖效益。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是在于提供了一種與豬乳頭數(shù)和背膘厚相關(guān)的snp分子標(biāo)記。通過gwas關(guān)聯(lián)分析4110頭丹系大白豬群體的全基因組填充數(shù)據(jù)，找到與總?cè)轭^數(shù)顯著相關(guān)的，效應(yīng)值最大的snp分子標(biāo)記。通過克隆豬7號染色體97377527-97378335區(qū)段基因序列，并運(yùn)用直接測序法尋找snp位點(diǎn)以及基因分型的方法，分析其與豬乳頭數(shù)和背膘厚性狀的關(guān)聯(lián)性，從而為豬的乳頭數(shù)和背膘厚性狀建立新的標(biāo)記輔助選擇位點(diǎn)。

2、本發(fā)明的另一個目的是在于提供了上述一種與豬乳頭數(shù)和背膘厚相關(guān)的snp分子標(biāo)記在提高豬乳頭數(shù)和降低背膘厚方面的應(yīng)用，該snp分子標(biāo)記的核苷酸序列中376位的r為等位基因替換，所述替換導(dǎo)致該位置產(chǎn)生多態(tài)性：在總?cè)轭^數(shù)、左乳頭數(shù)、右乳頭數(shù)、活體背膘厚性狀均呈現(xiàn)變化；該snp位點(diǎn)的tt基因型為豬乳頭數(shù)和背膘厚的有利基因型。本發(fā)明旨在發(fā)掘并鑒定與豬乳頭數(shù)和背膘厚性狀相關(guān)的snp位點(diǎn)，進(jìn)而為豬的遺傳選育工作提供重要指導(dǎo)意義。

3、本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

4、一種與豬乳頭數(shù)和背膘厚相關(guān)的snp分子標(biāo)記，所述snp分子標(biāo)記的位點(diǎn)對應(yīng)于豬7號染色體第97377527-97378335區(qū)段基因序列，片段長度為809bp，其核苷酸序列見附圖序列表seq?id?no.1所述，通過在ncbi網(wǎng)站進(jìn)行blast比對，發(fā)現(xiàn)該擴(kuò)增片段內(nèi)存在一處核苷酸多態(tài)性(snp)位點(diǎn)，具體如圖3所示。該snp位點(diǎn)的突變具體在7號染色體第97377902堿基處，堿基由c變?yōu)閠。根據(jù)ensembl數(shù)據(jù)庫查詢，該突變位點(diǎn)rs號為rs337505376；該snp分子標(biāo)記與總?cè)轭^數(shù)顯著相關(guān)。

5、試驗(yàn)材料選擇包括美系大白、丹系大白和法系大白。從這些豬的血液中提取全基因組dna，并根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫公布的豬基因序列(nc_010449.5)設(shè)計(jì)引物對。引物對的序列如下：

6、正向引物(seq?id?no.2)：5’-ccaatagcaagggttctc-3’，

7、反向引物(seq?id?no.3)：5’-ggatttaggtgttttaggc-3’。

8、上述引物對可對豬7號染色體第97377527-97378335區(qū)段基因區(qū)域的snp位點(diǎn)進(jìn)行檢測分型。

9、通過上述引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增、pcr產(chǎn)物的純化、克隆測序和序列比對分析后，篩選得到1個與豬總?cè)轭^數(shù)性狀關(guān)聯(lián)的遺傳標(biāo)記。該遺傳標(biāo)記的核苷酸序列如下seq?id?no.1所示：其中突變位點(diǎn)位于序列的第376位，ccaatagcaagggttctctttactaattatctttatttcctcatctcccacgaactcgtccatcagctgcagcctttaagacttcaaaccatgtgctctccccagtctttcttatacttgacctctcagcagaggtgagttaattatgccctgtcctgaatagtctgtgtattttctatttcttcggccatttttctttgcctttttggcagggacgggaggggggcacacctgtggcaagtggaagttcccaggccagggatcagacctgcaccacagcagtcacaatgctggatccttaacccactgagcaaggccagggattaaaccccaacctcatggttcctggtcggattcgtttccgctgtgccatgar(c/t)gggaactccaagactcaacttgatattgtttat?aagactctacatagtacctttacttctctagtttcctagcttgtggctttcctccttgctctctctacgctccggctgttcagaacatgtttcgtgctcacactgcccttgcacacgctgctccctcttgcctggaattatttcatcccatttccttggctcacattgattctttagctctcttaacactttgagtataggtgcaggttagttctgtaggcttgccagcaagaacttgaagatatactcatctgatggtttttatttcctctgaaggagggaaaaaaaaaaaggttaactcctgagaatgagaggggaagtagcagttggaaattgttaagtctcaacctcaggtctaggttaagtacctgattatggagtgcctaaaacacctaaatcc。

10、本發(fā)明提供了一種篩選與豬總?cè)轭^數(shù)性狀相關(guān)聯(lián)的遺傳標(biāo)記方法，所述的方法包括以下步驟：

11、從美系大白豬、丹系大白豬和法系大白豬的血液中提取基因組dna。根據(jù)該位點(diǎn)上游-375到下游433基因組序列設(shè)計(jì)引物。利用上述引物對豬基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，并通過直接測序法獲得該位點(diǎn)上游-375到下游433的核苷酸序列(序列詳見seq?id?no.1)，該序列中包含1個snp位點(diǎn)。利用該突變位點(diǎn)可作為遺傳標(biāo)記對美系大白豬、丹系大白豬、法系大白豬的乳頭數(shù)和背膘厚性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

12、本發(fā)明提供了一種用于檢測上述序列中snp位點(diǎn)的基因型分型方法。

13、本發(fā)明進(jìn)一步提供了利用直接測序法確定不同基因型個體與乳頭數(shù)和背膘厚性狀之間關(guān)聯(lián)分析的應(yīng)用，包括如下步驟：

14、為了確定豬7號染色體97377527-97378335區(qū)域內(nèi)的snp與豬表型差異的相關(guān)性，選擇美系大白豬、丹系大白豬和法系大白豬作為試驗(yàn)材料；通過直接測序法進(jìn)行多態(tài)性檢測，并分析多態(tài)性位點(diǎn)與豬乳頭數(shù)和背膘厚的相關(guān)性。采用sas統(tǒng)計(jì)軟件中混合線性模型(mixed)對基因型與表型值之間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行分析。

15、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：

16、通過全基因組關(guān)聯(lián)分析和貝葉斯精細(xì)定位篩選出位于豬7號染色體第97377902堿基處的snp分子標(biāo)記，該位點(diǎn)核苷酸序列中第376位的r為等位基因替換，所述替換導(dǎo)致該位置產(chǎn)生多態(tài)性?；?110頭丹系大白豬群體的全基因組填充數(shù)據(jù)，該snp位點(diǎn)與總?cè)轭^數(shù)性狀呈現(xiàn)全基因組顯著關(guān)聯(lián)，其p值為4.65×10-27，且貝葉斯精細(xì)定位顯示該位點(diǎn)具有最大效應(yīng)值，為0.22。其中，該snp分子標(biāo)記的核苷酸序列中376位的r為等位基因替換，所述替換導(dǎo)致該位置產(chǎn)生多態(tài)性：在總?cè)轭^數(shù)性狀中，該snp位點(diǎn)的tt基因型個體乳頭數(shù)較多；在左乳頭數(shù)性狀中，該snp位點(diǎn)的tt基因型個體乳頭數(shù)較多；在右乳頭數(shù)性狀中，該snp位點(diǎn)的tt基因型個體乳頭數(shù)較多；在活體背膘厚性狀中，該snp位點(diǎn)的tt基因型個體活體背膘厚較薄；該snp位點(diǎn)的tt基因型為豬乳頭數(shù)和背膘厚的有利基因型。本發(fā)明首次揭示該snp位點(diǎn)對豬乳頭數(shù)和背膘厚性狀的遺傳調(diào)控作用，為豬分子標(biāo)記輔助選育提供了高精度、高穩(wěn)定性的靶點(diǎn)，具有重要育種實(shí)踐價值。本發(fā)明旨在發(fā)掘并鑒定與豬乳頭數(shù)和背膘厚性狀相關(guān)的snp位點(diǎn)，進(jìn)而為豬的遺傳選育工作提供重要指導(dǎo)意義。