本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種高效的中華烏塘鱧精原細(xì)胞體外誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體精子的方法。

背景技術(shù)：

1、在大多數(shù)有性生殖動(dòng)物中，生殖細(xì)胞通過(guò)減數(shù)分裂產(chǎn)生具有遺傳多樣性的單倍體配子（精子或卵子），經(jīng)受精結(jié)合產(chǎn)生二倍體的受精卵，產(chǎn)生新的個(gè)體。生殖細(xì)胞是生物遺傳多樣性產(chǎn)生的根本，是種群繁衍和維持穩(wěn)定的關(guān)鍵。在農(nóng)業(yè)中，獲得高質(zhì)量的配子是創(chuàng)制優(yōu)良新品種的核心的基礎(chǔ)。優(yōu)良育種的本質(zhì)是對(duì)生殖細(xì)胞進(jìn)行定向選擇，保留和積累生長(zhǎng)、抗逆和風(fēng)味等優(yōu)良性狀，并且剔除易患病等不良性狀，批量生產(chǎn)性狀穩(wěn)定的后代。不少養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)成熟周期漫長(zhǎng)，例如草魚(yú)為5年、鱘為5~7年和石斑魚(yú)為4~5年，是培育優(yōu)良新品種的主要限制因素。在現(xiàn)有技術(shù)中，利用生殖干細(xì)胞移植技術(shù)，將供體生殖干細(xì)胞移植到成熟周期短、親緣關(guān)系近的不育魚(yú)類(lèi)受體中來(lái)產(chǎn)生供體來(lái)源的配子，是縮短育種周期的有效途徑。然而，供體生殖干細(xì)胞極容易被受體免疫排斥而清除，致使在受體魚(yú)類(lèi)產(chǎn)生供體配子的成功案例極少。因此，直接體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)生殖干細(xì)胞產(chǎn)生具有功能配子的研究，日益受到技術(shù)人員的關(guān)注。

2、在有性生殖動(dòng)物中，生殖干細(xì)胞是專(zhuān)職生殖功能的干細(xì)胞，包括胚胎期的原始生殖細(xì)胞（pgc）、幼年期的精原細(xì)胞和卵原細(xì)胞三大類(lèi)。在哺乳動(dòng)物等高等脊椎動(dòng)物中，pgc和卵原細(xì)胞僅存在于胚胎期，所以精原細(xì)胞（spermatogonial?stem?cells，ssc）是大多數(shù)成體動(dòng)物中唯一的數(shù)量多且能持續(xù)增殖和分化的生殖干細(xì)胞。ssc能夠通過(guò)有絲分裂維持自我更新，也能夠進(jìn)一步分化產(chǎn)生精母細(xì)胞，后者通過(guò)減數(shù)分裂產(chǎn)生單倍體精子。近年來(lái)，在一些重要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)中，例如：馬口魚(yú)、石斑魚(yú)、紅鰭東方鲀和黃河鯉中，研究人員從精巢分離了微弱表達(dá)數(shù)個(gè)生殖干細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞系，即“ssc細(xì)胞系”。雖然它們可以在體外無(wú)限增殖，分化形成不同類(lèi)型的細(xì)胞，甚至可以在性激素的誘導(dǎo)下形成有鞭毛的“類(lèi)精子”，但是產(chǎn)生的“類(lèi)精子”可能不具備正常精子的游動(dòng)能力和受精能力。這可能是因?yàn)轶w外長(zhǎng)期培養(yǎng)致使魚(yú)類(lèi)ssc基因組不完整所致。因此，通過(guò)建立穩(wěn)定的魚(yú)類(lèi)ssc細(xì)胞系，再對(duì)ssc進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)生正常功能的精子，可能效果不佳。因此，通過(guò)短暫原代培養(yǎng)ssc，保持其生殖干細(xì)胞功能的完整性，通過(guò)激素體外誘導(dǎo)其與支持細(xì)胞形成“類(lèi)精巢”器官，產(chǎn)生具有正常功能的精子，是目前更有效獲取育種精子的方法。

3、魚(yú)類(lèi)ssc誘導(dǎo)技術(shù)最早建立于日本鰻鱺；具體是：將日本鰻鱺的雄性生殖細(xì)胞與精巢體細(xì)胞或者細(xì)胞系共培養(yǎng)，在睪酮等性激素的作用下，細(xì)胞重構(gòu)成類(lèi)精巢器官的“圓形球塊”，并減數(shù)分裂產(chǎn)生精子，但是精子產(chǎn)生的效率極低，比例不超過(guò)10%。目前，研究人員通常在三維支架型培養(yǎng)材料中對(duì)魚(yú)類(lèi)ssc進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，使誘導(dǎo)效率提高；所述三維支架型培養(yǎng)材料是指利用人工高分子材料（聚己內(nèi)酯、聚乙醇酸等）或天然高分子材料（膠原蛋白、明膠、海藻酸鈉等）構(gòu)建多孔或纖維狀支架來(lái)模擬體內(nèi)細(xì)胞環(huán)境，為細(xì)胞提供物理支撐和附著表面并有利于細(xì)胞接觸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。如，本技術(shù)人在公布號(hào)為cn114480262a的中國(guó)專(zhuān)利中公開(kāi)一種3d體外培養(yǎng)中華烏塘鱧精原細(xì)胞產(chǎn)生功能精子的方法；該方法在以膠原蛋白作為支架的三維支架型培養(yǎng)材料transwell-col中誘導(dǎo)培養(yǎng)精原細(xì)胞，而且采用包含性激素和褪黑素的培養(yǎng)基，使中華烏塘鱧精原細(xì)胞培養(yǎng)4周后產(chǎn)生精子的比例達(dá)到17.13%。然而，該方法誘導(dǎo)中華烏塘鱧精原細(xì)胞產(chǎn)生單倍體精子的比例仍不高，而且至少需要2周以上才能形成直徑超過(guò)80?μm的“類(lèi)精巢”球塊結(jié)構(gòu)；其中“類(lèi)精巢”球塊的形成時(shí)間和體積大小也是衡量體外誘導(dǎo)精子產(chǎn)生效率的重要指標(biāo)，所以該方法仍存在誘導(dǎo)效率不高的缺陷，需作進(jìn)一步改進(jìn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種高效的中華烏塘鱧精原細(xì)胞體外誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體精子的方法，提高體外誘導(dǎo)精原細(xì)胞產(chǎn)生具有功能的精子的效率。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

3、一種高效的中華烏塘鱧精原細(xì)胞體外誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體精子的方法，包括以下步驟：

4、將精原細(xì)胞置于含有精子誘導(dǎo)培養(yǎng)基的三維非支架型培養(yǎng)材料中進(jìn)行培養(yǎng)；所述精子誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)精子培養(yǎng)基中添加性激素、褪黑素和erk1/2激活劑。

5、所述三維非支架型培養(yǎng)材料，顧名思義就是其中沒(méi)有人工高分子材料或天然高分子材料構(gòu)建的多孔或纖維狀支架；本發(fā)明所述三維非支架型培養(yǎng)材料具體采用球形微孔板（spherical?microplate，sm）。

6、在上述方法中，本發(fā)明首次提出利用三維非支架型培養(yǎng)材料球形微孔板（sm）進(jìn)行精原細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，替代常用的三維支架型材料。在所述三維非支架型培養(yǎng)材料sm內(nèi)，精原細(xì)胞與sm孔之間的粘附力較弱，精原細(xì)胞分泌細(xì)胞表面粘附因子，一方面作為信號(hào)分子吸引精原細(xì)胞之間相互遷移，另一方面通過(guò)共價(jià)結(jié)合連接精原細(xì)胞，使之形成三維聚集體，即“類(lèi)精巢”球塊；即本發(fā)明采用三維非支架型培養(yǎng)材料sm有利于精原細(xì)胞的遷移和匯合，因而顯著減少“類(lèi)精巢”球塊形成所需的時(shí)間，并且提高產(chǎn)生單倍體精子的比例。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，利用三維非支架型培養(yǎng)材料sm培養(yǎng)中華烏塘鱧精原細(xì)胞，僅培養(yǎng)1周就聚集形成明顯致密的細(xì)胞團(tuán)，即“類(lèi)精巢”球塊，這顯著優(yōu)于公布號(hào)為cn114480262a的中國(guó)專(zhuān)利利用三維支架型材料transwell-col（簡(jiǎn)稱(chēng)為tc）所需要的2周以上時(shí)間；而且，在非支架型sm中培養(yǎng)2周后產(chǎn)生單倍體精子的比例為25.34%，同樣顯著高于支架型材料tc中培育產(chǎn)生的單倍體精子比例6.87%。

7、本發(fā)明還采用包含erk1/2激活劑的精子誘導(dǎo)培養(yǎng)基，顯著促進(jìn)“類(lèi)精巢”球塊形成和提高產(chǎn)生單倍體精子的效率。本發(fā)明利用分子和細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在中華烏塘鱧精原細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中erk1/2信號(hào)會(huì)被激活；并且，由此通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相較于基礎(chǔ)精子培養(yǎng)基，向其中添加erk1/2激活劑，培養(yǎng)中華烏塘鱧精原細(xì)胞?2周后產(chǎn)生單倍體精子的比例從0.02%提升至6.23%。因此，erk1/2激活劑能夠顯著促進(jìn)中華烏塘鱧精原細(xì)胞體外精子的產(chǎn)生。

8、所述erk1/2激活劑是g蛋白βγ結(jié)合肽（msirk），cas號(hào)為593267-11-9。

9、所述erk1/2激活劑的添加量為0.5~3μm，優(yōu)選為1μm。

10、所述性激素包括5~20?u/ml人絨毛膜促性腺激素（hcg）、5~20?iu/ml妊娠母馬血清促性腺激素（pmsg）、50~200?ng/ml?11-酮睪酮（11-kt）、50~200?ng/ml睪酮（t）、50~200?ng/ml?17β-雌二醇（e2）和20~70?ng/ml?17α,20β-二羥基-4-孕3-酮（dhp）。

11、所述褪黑素的添加量為0.1~10?μm，優(yōu)選為1?μm。

12、本發(fā)明在精原細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，每隔3天更換一半新鮮的精子誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

13、所述基礎(chǔ)精子培養(yǎng)基為在dmem培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清，2%鱸魚(yú)血清，100?ng/ml?表皮生長(zhǎng)因子（egf），10?ng/ml?成纖維生長(zhǎng)因子（bfgf），100?ng/ml類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子1（ifg-i）和0.1?mm?β-巰基乙醇。

14、本發(fā)明可采用現(xiàn)有的手段獲取中華烏塘鱧精原細(xì)胞，具體可采用公布號(hào)為cn114480262a的中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)的中華烏塘鱧精原細(xì)胞分離方法。

15、本發(fā)明還提供一種高效的中華烏塘鱧精原細(xì)胞體外誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體精子的培養(yǎng)基，能顯著促進(jìn)“類(lèi)精巢”球塊的形成和提升產(chǎn)生單倍體精子的效率，其包括基礎(chǔ)精子培養(yǎng)基及向其添加的性激素、褪黑素和erk1/2激活劑。

16、所述erk1/2激活劑是msirk，添加量為0.5~3?μm，優(yōu)選為1?μm。

17、所述性激素包括5~20?u/ml人絨毛膜促性腺激素（hcg）、5~20?iu/ml妊娠母馬血清促性腺激素（pmsg）、50~200?ng/ml?11-酮睪酮（11-kt）、50~200?ng/ml睪酮（t）、50~200?ng/ml?17β-雌二醇（e2）和20~70?ng/ml?17α,20β-二羥基-4-孕3-酮（dhp）。

18、所述褪黑素的添加量為0.1~10?μm，優(yōu)選為1?μm。

19、所述基礎(chǔ)精子培養(yǎng)基為在dmem培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清，2%鱸魚(yú)血清，100?ng/ml?表皮生長(zhǎng)因子（egf），10?ng/ml?成纖維生長(zhǎng)因子（bfgf），100?ng/ml類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子1（ifg-i）和0.1?mm?β-巰基乙醇。

20、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

21、本發(fā)明采用三維非支架型培養(yǎng)材料sm培養(yǎng)中華烏塘鱧精原細(xì)胞，相較于現(xiàn)有技術(shù)采用的三維支架型材料，在縮短“類(lèi)精巢”球塊形成時(shí)間和提高產(chǎn)生單倍體的精子效率方面具有顯著的優(yōu)異性。同時(shí)，本發(fā)明采用包含erk1/2激活劑的精子誘導(dǎo)培養(yǎng)基，顯著促進(jìn)“類(lèi)精巢”球塊形成和提高產(chǎn)生單倍體精子的效率。

22、綜上，本發(fā)明能夠提高體外誘導(dǎo)中華烏塘鱧精原細(xì)胞產(chǎn)生具有功能的精子的效率。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，相較于現(xiàn)有技術(shù)，在本發(fā)明方法中“類(lèi)精巢”球塊形成的時(shí)間從2周以上縮短為1周，且培養(yǎng)2周后產(chǎn)生單倍體精子的比例從6.87%提高到30.93%；此外，本發(fā)明體外誘導(dǎo)產(chǎn)生的精子與成熟卵子進(jìn)行授精的受精率與現(xiàn)有技術(shù)相當(dāng)。換言之，本發(fā)明大幅提升了體外誘導(dǎo)精子發(fā)生效率，有望成為一種加速魚(yú)類(lèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖遺傳育種和改良的新策略。