本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種肝素前體含量的檢測方法及其應(yīng)用，特別是一種發(fā)酵液中肝素前體含量的檢測方法。

背景技術(shù)：

1、肝素前體多糖屬于糖胺聚糖，是葡萄糖醛酸glcua和乙酰葡萄糖胺glcnac交替形成的二糖重復(fù)單元，在多種細(xì)菌的莢膜中大量存在，目前肝素前體主要從大腸桿菌k5中提取。肝素前體（heparosan）具有與肝素/硫酸乙酰肝素類似的多糖骨架結(jié)構(gòu)，經(jīng)適當(dāng)修飾能夠得到非動物源的肝素或其類似物。因此，肝素前體成為肝素酶法合成的理想原料。肝素前體的結(jié)構(gòu)式如下所示：

2、。

3、一方面，肝素前體在眼科、整形外科、皮膚病學(xué)以及醫(yī)療器械的涂層方面具有潛在的應(yīng)用；肝素前體和肝素前體衍生物也是組織工程用凝膠和支架的高質(zhì)量生物材料以及藥物遞送載體的良好候選物；肝素前體還可制成藥物載體以增強抗癌藥物的靶向性，在醫(yī)藥開發(fā)領(lǐng)域有重要應(yīng)用前景。利用微生物發(fā)酵高效、低成本地獲得分子量可控的肝素前體具有重要的應(yīng)用價值和戰(zhàn)略意義。但在肝素前體生物發(fā)酵過程中，發(fā)酵液中會含有大量小分子并產(chǎn)生乙酸等物質(zhì)，對肝素前體發(fā)酵液中的肝素前體含量的檢測有影響。

4、目前關(guān)于肝素前體含量的檢測和質(zhì)控方法報道不多，肝素前體含量的檢測一般使用硫酸-咔唑法，其適用于測定酸性多糖中的糖醛酸含量，酸性多糖在濃硫酸的作用下水解出葡萄糖醛酸，在硫酸存在下與咔唑反應(yīng)，生成具有羰基的紫紅色化合物，該具有羰基的紫紅色化合物在530?nm波長具有最大吸收。肝素前體多糖由乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸組成，其中葡萄糖醛酸含量的百分比為45.56%，通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可根據(jù)葡萄糖醛酸的含量來檢測樣品中肝素前體的含量。

5、但是，使用硫酸-咔唑法測肝素前體含量最大的問題是專屬性差，易受試劑或樣品中雜質(zhì)（肝素前體類似物、殘留培養(yǎng)基）的干擾，存在操作繁瑣、反應(yīng)試劑和反應(yīng)條件劇烈對人員不友好、重現(xiàn)性差、干擾因素多、專屬性差以及準(zhǔn)確性低等缺點。

6、1h-nmr技術(shù)能夠有效檢測樣品中的不同化學(xué)結(jié)構(gòu)，通過區(qū)分不同結(jié)構(gòu)的化學(xué)位移，能夠幫助識別肝素前體與其他雜質(zhì)。由于nmr信號的強度與相應(yīng)結(jié)構(gòu)中氫原子的數(shù)量成正比，因此該技術(shù)不僅可以用于定性分析，還能夠進(jìn)行定量測定。

7、在核磁共振（nmr）定量實驗中，如果待測分子是電解質(zhì)，隨著其濃度的增加，樣品的導(dǎo)電性也隨之增強；而導(dǎo)電性的提升會導(dǎo)致樣品的信噪比降低，從而使得樣品信號與濃度之間的關(guān)系不成線性。為提高準(zhǔn)確性，通常加入已知濃度的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)（如苯甲醇），通過對信號進(jìn)行積分并結(jié)合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)濃度推算目標(biāo)物質(zhì)的濃度。然而，肝素類物質(zhì)為生物大分子，其1h-nmr信號分布廣且復(fù)雜，難以找到與其信號不重疊的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，且內(nèi)標(biāo)物質(zhì)可能與肝素或雜質(zhì)發(fā)生相互作用，影響定量結(jié)果。因此，使用nmr技術(shù)進(jìn)行肝素前體定量仍面臨挑戰(zhàn)。

8、對肝素前體進(jìn)行含量控制一直是肝素前體的研發(fā)、生產(chǎn)及利用過程中的重點和難點，目前肝素前體的含量測定及含量檢測方法有諸多缺點。因此，亟需開發(fā)出一種肝素前體的含量控制及含量檢測方法，以確保肝素前體在發(fā)酵制備及應(yīng)用過程中含量檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種肝素前體含量的檢測方法及其應(yīng)用，特別是一種發(fā)酵液中肝素前體含量的檢測方法及其應(yīng)用。所述方法是將樣品的濃度與其1h-nmr譜圖中特征氫信號核磁共振氫譜峰面積a與360°脈寬θ360的乘積a×θ360進(jìn)行線性關(guān)聯(lián)，所述方法不需要在核磁樣品中加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)就可以直接在核磁樣品中快速測試得到肝素前體的濃度；具體地，所述方法是利用在不同體系下（如d2o、d2o-h2o或d2o-發(fā)酵液）建立的肝素前體氫譜a×θ360與肝素前體濃度c的線性關(guān)系，成功測定了不同體系中肝素前體的濃度，測定結(jié)果準(zhǔn)確度高。本發(fā)明的方法實現(xiàn)了肝素前體的高效、快速定量檢測，避免了傳統(tǒng)方法中肝素前體樣品處理和純化步驟的復(fù)雜性，從而提高生產(chǎn)過程中的實時監(jiān)控能力，優(yōu)化肝素生產(chǎn)的效率和質(zhì)量控制，所述方法在肝素工業(yè)生產(chǎn)中具有重要的應(yīng)用價值。

2、為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種肝素前體含量的檢測方法，所述檢測方法包括：

4、（s1）采用核磁共振波譜分析法分別測定肝素前體對照品溶液、肝素前體供試品溶液的360°脈寬θ360和特征氫信號核磁共振氫譜峰面積a，計算特征氫信號核磁共振氫譜峰面積a與360°脈寬θ360的乘積a×θ360；

5、（s2）應(yīng)用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，建立肝素前體對照品溶液的特征氫信號核磁共振氫譜峰面積a與360°脈寬θ360的乘積y、肝素前體對照品溶液的濃度x兩者之間的數(shù)學(xué)關(guān)系，y＝kx+b；

6、（s3）根據(jù)步驟（s2）的數(shù)學(xué)關(guān)系計算肝素前體待測樣品溶液中肝素前體的濃度；其中，肝素前體待測樣品溶液中肝素前體濃度的計算公式為：

7、

8、上式中，a供試品為肝素前體供試品溶液的特征氫信號核磁共振氫譜峰面積；θ360為肝素前體供試品溶液的360°脈寬；k為線性方程斜率；b為線性方程截距；n為肝素前體待測樣品溶液稀釋為肝素前體供試品的稀釋倍數(shù)。

9、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述肝素前體待測樣品溶液經(jīng)過稀釋后變成肝素前體供試品溶液，稀釋倍數(shù)為n，n為大于等于1的數(shù)；示例性地，n=肝素前體供試品溶液的體積與肝素前體待測樣品溶液的體積的比值。

10、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述方法還包括如下步驟：

11、（s0）將肝素前體對照品配制成肝素前體對照品溶液；將肝素前體待測樣品配制成肝素前體供試品溶液。

12、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述方法是一種簡單快速的檢測肝素前體含量的核磁共振方法，特別是一種快速、定量檢測發(fā)酵液中肝素前體含量的核磁共振方法。所述方法將樣品的濃度與1h-nmr譜圖中特征氫信號核磁共振氫譜峰面積a與360°脈寬θ360的乘積a×θ360進(jìn)行線性關(guān)聯(lián)，不需要在核磁樣品中加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)就可以實現(xiàn)直接在核磁樣品中快速測量肝素前體的含量。

13、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟（s1）中，所述肝素前體對照品溶液中，肝素前體的濃度為0.25-20.0mg/ml；優(yōu)選為0.75-15.0mg/ml，例如為0.25mg/ml、0.625mg/ml、0.75mg/ml、1.5mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml、7.5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml或20.0mg/ml。

14、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟（s1）中，所述肝素前體對照品溶液包括肝素前體和重水d2o；或者所述肝素前體對照品溶液包括肝素前體、重水d2o和水h2o；或者所述肝素前體對照品溶液包括肝素前體、重水d2o和發(fā)酵液。

15、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟（s1）中，所述肝素前體對照品溶液包括肝素前體、重水d2o和水h2o時，重水d2o和水h2o的體積比為5-20:95-80，例如為5:95、10:90、15:85或20:80。

16、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟（s1）中，所述肝素前體對照品溶液包括肝素前體、重水d2o和發(fā)酵液時，重水d2o和發(fā)酵液的體積比為5-20:95-80，例如為5:95、10:90、15:85或20:80。

17、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述發(fā)酵液包括發(fā)酵上清液。

18、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述發(fā)酵液不包括肝素前體。

19、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所發(fā)酵液可以通過本領(lǐng)域已知的方法制備得到，也可以通過商業(yè)途徑購買后獲得；示例性地，所述發(fā)酵液可以通過下述方法制備得到：

20、將不表達(dá)肝素前體的ecoli甘油菌在培養(yǎng)基中發(fā)酵，收集上清液。

21、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，示例性地，所述發(fā)酵的條件為本領(lǐng)域已知的，如所述發(fā)酵的條件滿足：在搖床中，37℃、200rpm條件下培養(yǎng)8-12小時后，再在30℃、200rpm條件下培養(yǎng)48小時。更為具體地，取200ml經(jīng)滅菌的培養(yǎng)基加入3ml50%的甘油（滅菌），然后向其中加入100μl不表達(dá)肝素前體的ecoli甘油菌；轉(zhuǎn)入搖床中，37℃、200rpm過夜培養(yǎng)；第二天，溫度變?yōu)?0℃，繼續(xù)培養(yǎng)2天；發(fā)酵完成后，發(fā)酵液轉(zhuǎn)入離心管中，10000rpm離心10min，得上清液；上清液于沸水中放置10min，10000rpm離心10min，取上清液，即得發(fā)酵液。

22、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述發(fā)酵液為本領(lǐng)域已知的能夠生成肝素前體的發(fā)酵液即可；示例性地，所述發(fā)酵液為lb發(fā)酵液、soc發(fā)酵液或tb發(fā)酵液。

23、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述lb發(fā)酵液選用的培養(yǎng)基為lb培養(yǎng)基（luria-bertanibroth）。

24、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述lb培養(yǎng)基包括蛋白胨、酵母、氯化鈉和水。

25、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述lb培養(yǎng)基包括如下濃度的各組分：5-30g/l的蛋白胨、5-25g/l的酵母和1-10g/l的氯化鈉，溶劑為水。示例性地，所述lb培養(yǎng)基包括如下濃度的各組分：16g/l蛋白胨、10g/l酵母和5g/l氯化鈉，溶劑為水。

26、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述soc發(fā)酵液選用的培養(yǎng)基為soc培養(yǎng)基（superoptimal?broth?with?catabolite?repression）。

27、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述soc培養(yǎng)基包括蛋白胨、酵母、氯化鈉、葡萄糖、氯化鎂、硫酸鎂和水。

28、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述soc培養(yǎng)基包括如下濃度的各組分：5-30g/l的蛋白胨、1-10g/l的酵母、5-25g/l的氯化鈉、10-30mm的葡萄糖、5-20mm的氯化鎂和5-20mm的硫酸鎂，溶劑為水。示例性地，所述soc培養(yǎng)基包括如下濃度的各組分：16g/l蛋白胨、5g/l酵母、10g/l氯化鈉、20mm的葡萄糖、10mm的氯化鎂和10mm的硫酸鎂，溶劑為水。

29、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述tb發(fā)酵液選用的培養(yǎng)基為tb培養(yǎng)基（terrificbroth）。

30、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述tb培養(yǎng)基包括蛋白胨、酵母、甘油和/或葡萄糖、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀。

31、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述tb培養(yǎng)基包括如下濃度的各組分：10-20g/l蛋白胨、20-30g/l酵母、2-8g/l甘油和/或葡萄糖、1.5-5g/l磷酸二氫鉀和10-20g/l磷酸氫二鉀。

32、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟（s1）中，所述肝素前體供試品溶液中，肝素前體的濃度為0.25-20.0mg/ml；優(yōu)選為0.75-15.0mg/ml。

33、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟（s1）中，所述肝素前體對照品溶液和肝素前體供試品溶液的組成相同，即當(dāng)所述肝素前體供試品溶液包括發(fā)酵液時，所述肝素前體對照品溶液中也包括發(fā)酵液，且發(fā)酵液的組成相同；當(dāng)所述肝素前體供試品溶液包括水h2o時，所述肝素前體對照品溶液中也包括水h2o；當(dāng)所述肝素前體供試品溶液包括重水d2o時，所述肝素前體對照品溶液中也包括重水d2o。

34、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟（s1）中，所述肝素前體供試品溶液是通過如下方法制備得到的：將表達(dá)肝素前體的ecoli甘油菌在培養(yǎng)基中發(fā)酵，收集上清液，制備得到所述肝素前體待測樣品溶液；加入重水d2o以及任選地加入或不加入稀釋劑，獲得肝素前體的濃度為0.25-20.0mg/ml的肝素前體供試品溶液。其中，所述稀釋劑為重水d2o或者為重水d2o和水h2o的混合溶液，或者為含有重水d2o的發(fā)酵液，其中重水d2o和水h2o的體積比優(yōu)選為5-20:95-80，例如為5:95、10:90、15:85或20:80；重水d2o和發(fā)酵液的體積比為5-20:95-80，例如為5:95、10:90、15:85或20:80。若加入重水d2o后肝素前體供試品溶液的濃度較高（>20.0mg/ml），則可以加入稀釋劑進(jìn)一步稀釋肝素前體供試品溶液的濃度，從而獲得肝素前體濃度為0.25-20.0mg/ml的肝素前體供試品溶液。

35、示例性地，向所述肝素前體待測樣品溶液中加入重水d2o，獲得肝素前體的濃度為0.25-20.0mg/ml的肝素前體供試品溶液；或者，向所述肝素前體待測樣品溶液中加入重水d2o以及重水d2o和水h2o的混合溶液，獲得肝素前體的濃度為0.25-20.0mg/ml的肝素前體供試品溶液；或者，向所述肝素前體待測樣品溶液中加入重水d2o以及含有重水d2o的發(fā)酵液，獲得肝素前體的濃度為0.25-20.0mg/ml的肝素前體供試品溶液。

36、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述表達(dá)肝素前體的ecoli甘油菌的發(fā)酵條件與不表達(dá)肝素前體的ecoli甘油菌的發(fā)酵條件相同。本發(fā)明中，所述表達(dá)肝素前體的ecoli甘油菌與不表達(dá)肝素前體的ecoli甘油菌區(qū)別僅在于表達(dá)肝素前體的ecoli甘油菌含有表達(dá)肝素前體的相關(guān)基因，不表達(dá)肝素前體的ecoli甘油菌中僅含空質(zhì)粒。

37、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，影響核磁共振信號的因素有磁場強度、溫度、濃度、儀器參數(shù)以及化學(xué)環(huán)境等，在磁場強度、溫度、濃度以及儀器參數(shù)等一致的情況下，在不同溶液環(huán)境下的核磁共振信號可能存在較大的差異。因此，在本發(fā)明中，優(yōu)選肝素前體對照品溶液和肝素前體供試品溶液的組成相同，以確保肝素前體對照品溶液與肝素前體供試品溶液的溶液條件的一致性，從而得到更高的結(jié)果準(zhǔn)確性。

38、作為優(yōu)選方案，當(dāng)所述肝素前體供試品溶液包括重水d2o和發(fā)酵液時，所述肝素前體對照品溶液中也包括重水d2o和發(fā)酵液，且肝素前體對照品溶液中的發(fā)酵液與肝素前體供試品溶液中的發(fā)酵液的組成相同，肝素前體對照品溶液中重水d2o和發(fā)酵液的體積比與肝素前體供試品溶液中重水d2o和發(fā)酵液的體積比相同。這可以通過將不含肝素前體的發(fā)酵液配制一系列濃度梯度的肝素前體對照品溶液的方式獲得。

39、作為優(yōu)選方案，當(dāng)所述肝素前體供試品溶液包括重水d2o和水h2o時，所述肝素前體對照品溶液中也包括重水d2o和水h2o，且肝素前體對照品溶液中重水d2o和水h2o的體積比與肝素前體供試品溶液中重水d2o和水h2o的體積比相同。這可以通過將肝素前體溶解于重水d2o和水h2o中，配制一系列濃度梯度的肝素前體對照品溶液的方式獲得。

40、作為優(yōu)選方案，當(dāng)所述肝素前體供試品溶液包括重水d2o時，所述肝素前體對照品溶液中也包括重水d2o。這可以通過將肝素前體溶解于重水d2o中，配制一系列濃度梯度的肝素前體對照品溶液的方式獲得。

41、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟（s1）中，所述核磁共振波譜分析采用的核磁共振儀為脈沖傅里葉變換（pft）波譜儀；示例性地，所述核磁共振儀為布魯克核磁共振儀。

42、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，對于樣品的360°脈寬θ360，可以采用任意的脈沖序列進(jìn)行檢測（優(yōu)選核磁共振中用于一維譜圖采集的脈沖序列），因為對于同一樣品采用任意的脈沖序列檢測的360°脈寬θ360均相等。為了方便檢測，可以選用相對簡單的zg脈沖序列進(jìn)行檢測。

43、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，測定所述360°脈寬θ360的核磁共振波譜分析法的檢測條件如下表a所示：

44、表a?核磁共振波譜分析法的檢測條件

45、

46、根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，測定所述360°脈寬θ360的核磁共振波譜分析法的檢測條件如下表b所示：

47、表b?核磁共振波譜分析法的檢測條件

48、

49、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述360°脈寬θ360的計算步驟包括：按照上述檢測條件采集肝素前體的氫譜，再進(jìn)行傅里葉變換（efp），進(jìn)行相位和基線的校正，進(jìn)行90°脈寬的計算，得到90°脈寬p1，將p1值乘4即得360°脈寬θ360。其中，90°脈寬的計算是通過輸入指令“pulsecal”來實現(xiàn)的。

50、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，可以采用ledbppg2s1d脈沖序列測定所述特征氫信號核磁共振氫譜峰面積。

51、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，測定所述特征氫信號核磁共振氫譜峰面積的核磁共振波譜分析法的檢測條件如下表c所示：

52、表c?核磁共振波譜分析法的檢測條件

53、

54、根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，測定所述特征氫信號核磁共振氫譜峰面積的核磁共振波譜分析法的檢測條件如下表d所示：

55、表d?核磁共振波譜分析法的檢測條件

56、

57、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，可以采用zgcppr脈沖序列測定所述特征氫信號核磁共振氫譜峰面積。

58、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，測定所述特征氫信號核磁共振氫譜峰面積的核磁共振波譜分析法的檢測條件如下表e所示：

59、表e?核磁共振波譜分析法的檢測條件

60、

61、根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，測定所述特征氫信號核磁共振氫譜峰面積的核磁共振波譜分析法的檢測條件如下表f所示：

62、表f?核磁共振波譜分析法的檢測條件

63、

64、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，可以采用zggpw5脈沖序列測定所述特征氫信號核磁共振氫譜峰面積。

65、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，測定所述特征氫信號核磁共振氫譜峰面積的核磁共振波譜分析法的檢測條件如下表g所示：

66、表g?核磁共振波譜分析法的檢測條件

67、

68、根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，測定所述特征氫信號核磁共振氫譜峰面積的核磁共振波譜分析法的檢測條件如下表h所示：

69、表h?核磁共振波譜分析法的檢測條件

70、

71、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，在重水d2o和發(fā)酵液體系下，在核磁共振波譜分析法中選擇ledbppg2s1d脈沖序列測定特征氫信號核磁共振氫譜峰面積a，建立肝素前體氫譜a×θ360與肝素前體濃度c的線性關(guān)系，從而可以測定在重水d2o和發(fā)酵液體系中肝素前體的濃度。此方法適用于對制備過程（發(fā)酵過程）中的肝素前體粗品中的肝素前體含量進(jìn)行檢測。

72、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，在重水d2o和水h2o體系下，在核磁共振波譜分析法中選擇ledbppg2s1d脈沖序列測定特征氫信號核磁共振氫譜峰面積a，建立肝素前體氫譜a×θ360與肝素前體濃度c的線性關(guān)系，從而可以測定在重水d2o和水h2o體系中肝素前體的濃度。此方法適用于對制備得到的肝素前體成品中的肝素前體含量進(jìn)行檢測。

73、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，在重水d2o體系下，在核磁共振波譜分析法中選擇ledbppg2s1d脈沖序列測定特征氫信號核磁共振氫譜峰面積a，建立肝素前體氫譜a×θ360與肝素前體濃度c的線性關(guān)系，從而可以測定在重水d2o體系中肝素前體的濃度。此方法適用于對制備得到的肝素前體成品中的肝素前體含量進(jìn)行檢測。

74、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，在重水d2o和水h2o體系下，在核磁共振波譜分析法中選擇zggpw5脈沖序列測定特征氫信號核磁共振氫譜峰面積a，建立肝素前體氫譜a×θ360與肝素前體濃度c的線性關(guān)系，從而可以測定在重水d2o和水h2o體系中肝素前體的濃度。此方法適用于對制備得到的肝素前體成品中的肝素前體含量進(jìn)行檢測。

75、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，在重水d2o體系下，在核磁共振波譜分析法中選擇zggpw5脈沖序列測定特征氫信號核磁共振氫譜峰面積a，建立肝素前體氫譜a×θ360與肝素前體濃度c的線性關(guān)系，從而可以測定在重水d2o體系中肝素前體的濃度。此方法適用于對制備得到的肝素前體成品中的肝素前體含量進(jìn)行檢測。

76、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，在重水d2o體系下，在核磁共振波譜分析法中選擇zgcppr脈沖序列測定特征氫信號核磁共振氫譜峰面積a，建立肝素前體氫譜a×θ360與肝素前體濃度c的線性關(guān)系，從而可以測定在重水d2o體系中肝素前體的濃度。此方法適用于對制備得到的肝素前體成品中的肝素前體含量進(jìn)行檢測。

77、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，通過在ledbppg2s1d脈沖序列的條件下測定特征氫信號核磁共振氫譜峰面積a，可以有效濾除發(fā)酵液中培養(yǎng)基成分和代謝物小分子的信號干擾，極大的提高了發(fā)酵液中肝素前體氫譜的譜圖質(zhì)量；并且在重水d2o、重水d2o和水h2o體系、重水d2o和發(fā)酵液體系中驗證了選擇ledbppg2s1d脈沖序列測定肝素前體的可行性，采集了不同濃度肝素前體對照品溶液的氫譜和測定360°脈寬θ360，其特征氫信號核磁共振氫譜峰面積a與360°脈寬θ360的乘積a×θ360與肝素前體的濃度成線性關(guān)系。

78、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，通過在zggpw5脈沖序列的條件下測定特征氫信號核磁共振氫譜峰面積a，在重水d2o、重水d2o和水h2o體系中驗證了選擇zggpw5脈沖序列測定肝素前體的可行性，采集了不同濃度肝素前體對照品溶液的氫譜和測定360°脈寬θ360，其特征氫信號核磁共振氫譜峰面積a與360°脈寬θ360的乘積a×θ360與肝素前體的濃度成線性關(guān)系。

79、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，通過在zgcppr脈沖序列的條件下測定特征氫信號核磁共振氫譜峰面積a，在重水d2o體系中驗證了選擇zgcppr脈沖序列測定肝素前體的可行性，采集了不同濃度肝素前體對照品溶液的氫譜和測定360°脈寬θ360，其特征氫信號核磁共振氫譜峰面積a與360°脈寬θ360的乘積a×θ360與肝素前體的濃度成線性關(guān)系。

80、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，通過對比不同的脈沖序列zgcppr、zggpw5和ledbppg2s1d的檢測效果，結(jié)果表明，脈沖序列設(shè)置為ledbppg2s1d時，其對于發(fā)酵液中肝素前體的檢測效果更好；相比之下，脈沖序列zgcpprr和zggpw5更適合高純度肝素前體的檢測，并不適用于發(fā)酵液的檢測。

81、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，通過利用在不同體系下（如重水d2o、重水d2o-水h2o或重水d2o-發(fā)酵液）建立的肝素前體氫譜a×θ360與發(fā)酵液中肝素前體的濃度的線性關(guān)系，成功測定了不同體系中肝素前體的濃度，測定結(jié)果準(zhǔn)確度較高，其回收率大于99%，符合檢測要求。

82、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述肝素前體的特征氫信號是指肝素前體n乙酰基（nac）上甲基氫原子信號。

83、第二方面，本發(fā)明提供一種第一方面所述的肝素前體含量的檢測方法在肝素前體檢測中的應(yīng)用。

84、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述肝素前體含量的檢測方法應(yīng)用于肝素前體發(fā)酵過程中的監(jiān)控，從而確定發(fā)酵是否完成。

85、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述肝素前體含量的檢測方法應(yīng)用于大腸桿菌改造過程中，高肝素前體產(chǎn)率的大腸桿菌的篩選，從而獲得高肝素前體產(chǎn)率的大腸桿菌。

86、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述肝素前體含量的檢測方法應(yīng)用于肝素前體制備過程及純化過程中的監(jiān)控，從而確定制備得到的肝素前體的純度是否符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求。

87、本發(fā)明所述的數(shù)值范圍不僅包括上述列舉的點值，還包括沒有列舉出的上述數(shù)值范圍之間的任意的點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

88、相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

89、（1）本發(fā)明提供了一種肝素前體含量的檢測方法，特別是提供了一種利用核磁共振波譜法檢測發(fā)酵液中肝素前體含量的方法。該檢測方法可用于對制備過程（發(fā)酵過程）中的肝素前體粗品和制備得到的肝素前體成品中的肝素前體含量進(jìn)行檢測。該檢測方法具有操作條件溫和、靈敏度高的特點。該檢測方法能夠高效、快速檢測出制備過程中的肝素前體粗品和制備得到的肝素前體成品中肝素前體的含量，便于應(yīng)用于工業(yè)化大生產(chǎn)。

90、（2）本發(fā)明提供的肝素前體含量的檢測方法具有高效、快速和適應(yīng)能力強的特點，所述檢測方法不需要對待測樣品進(jìn)行前處理，也不需要對待測樣品進(jìn)行特殊化學(xué)修飾或標(biāo)記，就能夠快速、定量檢測出待測樣品中肝素前體的含量；所述檢測方法是基于獲得的待測樣品的氫譜信號，從而分析并判斷待測樣品的結(jié)構(gòu)，以及推斷是否有雜質(zhì)類似物的存在；所述檢測方法能夠克服反應(yīng)體系中其他物質(zhì)（如發(fā)酵液中培養(yǎng)基成分和代謝物小分子）對反應(yīng)結(jié)果的信號干擾。所述檢測方法適合高通量檢測，所述檢測方法可以在短時間內(nèi)獲得多個樣本的核磁譜圖。所述檢測方法更簡便、快速、高效，檢測結(jié)果更客觀，適用于工業(yè)化大生產(chǎn)。

91、（3）在硫酸-咔唑法測定肝素前體含量的實驗中，從實驗結(jié)果中可知，對照實驗組中的純化水組和空白培養(yǎng)基組也有吸光度，說明硫酸-咔唑法測定肝素前體存在誤差。本發(fā)明的肝素前體的核磁共振波譜檢測方法能夠有效克服實驗過程中空白培養(yǎng)基和咔唑等試劑的引入對檢測結(jié)果的影響，本發(fā)明的肝素前體的核磁共振波譜檢測方法的準(zhǔn)確度更高、精密度更好、能夠更直觀的提供檢測結(jié)果。