本發(fā)明屬于外泌體修飾，尤其涉及基于雙向負(fù)載模塊的通用工程外泌體構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

1、外泌體（extracellular?vesicle,?ev）是一類由細(xì)胞主動(dòng)分泌產(chǎn)生的膜性囊泡，其直徑約為30-150?nm，具有完整的脂質(zhì)雙分子膜結(jié)構(gòu)，并攜帶細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等生物活性物質(zhì)。近年來(lái)，外泌體憑借其固有的生物相容性、較低的免疫原性、天然的靶向性及良好的體內(nèi)穩(wěn)定性，在腫瘤治療、自身免疫性疾病調(diào)控、組織損傷修復(fù)及藥物遞送體系開發(fā)等領(lǐng)域得到了廣泛關(guān)注和深入研究。特別是來(lái)源于同種甚至自體細(xì)胞的外泌體，由于其顯著的同源歸巢特性及免疫逃逸能力，更適合用于構(gòu)建長(zhǎng)期穩(wěn)定、安全有效的藥物遞送載體，具有重要的臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值。

2、然而，盡管真核細(xì)胞來(lái)源的外泌體在治療遞送領(lǐng)域具有天然優(yōu)勢(shì)，目前的技術(shù)仍難以實(shí)現(xiàn)外泌體表面的高效修飾和功能化。傳統(tǒng)的外泌體表面修飾策略通常依賴非特異性相互作用，如靜電吸附、范德華力或氫鍵。這些方法在體內(nèi)復(fù)雜的生理環(huán)境下易受血漿蛋白和離子的競(jìng)爭(zhēng)干擾，導(dǎo)致功能分子與外泌體結(jié)合的穩(wěn)定性低、釋放不受控、靶向遞送效率不理想，進(jìn)而影響治療效果。為克服上述缺陷，研究人員嘗試使用化學(xué)交聯(lián)劑（如靶向氨基、羧基或巰基的交聯(lián)劑）進(jìn)行外泌體的共價(jià)修飾，雖然一定程度上增強(qiáng)了連接穩(wěn)定性，但此類反應(yīng)往往條件苛刻、特異性不足，極易破壞外泌體的膜結(jié)構(gòu)與功能，降低生物相容性，嚴(yán)重限制了其在體內(nèi)的有效應(yīng)用。

3、近年來(lái)，“鏈球菌來(lái)源異肽橋接系統(tǒng)”因其高度特異性、穩(wěn)定的共價(jià)連接以及溫和的反應(yīng)條件，已在納米顆粒功能化、蛋白質(zhì)固定化及疫苗開發(fā)等領(lǐng)域取得成功應(yīng)用。該類系統(tǒng)以鏈球菌屬（如streptococcus?pyogenes、streptococcus?pneumoniae、streptococcusdysgalactiae等）表面蛋白結(jié)構(gòu)域?yàn)榛A(chǔ)，通過(guò)異肽鍵形成實(shí)現(xiàn)tag與catcher之間的自發(fā)、不可逆共價(jià)結(jié)合，代表性成員包括spycatcher/spytag、snoopcatcher/snooptag、dogcatcher/dogtag及sdycatcher/sdytag等（以下簡(jiǎn)稱為catcher和tag）。然而，由于真核細(xì)胞膜蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜、跨膜運(yùn)輸途徑精細(xì)調(diào)控，且原核來(lái)源蛋白融合表達(dá)存在空間構(gòu)象限制，在真核細(xì)胞來(lái)源外泌體膜表面有效表達(dá)和錨定此類tag/catcher模塊仍面臨巨大技術(shù)挑戰(zhàn)。尤其是如何在不影響外泌體生物發(fā)生過(guò)程及膜蛋白天然功能的前提下，將外源功能蛋白精準(zhǔn)、高效地錨定位于外泌體膜表面，并實(shí)現(xiàn)與功能載荷的高效穩(wěn)定結(jié)合，至今尚未見普遍有效的解決方案。

4、與此同時(shí)，外泌體運(yùn)載特定rna分子用于臨床治療也是當(dāng)前的外泌體應(yīng)用熱點(diǎn)之一，然而如何將特定rna分子高效富集于外泌體內(nèi)腔同樣是當(dāng)前外泌體工程化改造中的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)rna裝載方式多為被動(dòng)包裹，裝載效率低下且不具備針對(duì)性。因此，亟需開發(fā)一種綜合上述優(yōu)勢(shì)，能夠同時(shí)在外泌體膜表面實(shí)現(xiàn)高效共價(jià)修飾、在外泌體內(nèi)腔高效富集特定rna的工程化雙向負(fù)載外泌體構(gòu)建平臺(tái)，從而顯著提升外泌體在腫瘤免疫治療、靶向藥物遞送、rna治療、疫苗載體或納米材料展示等領(lǐng)域的應(yīng)用效能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了基于雙向負(fù)載模塊的通用工程外泌體構(gòu)建方法，其目的在于解決背景技術(shù)中所提到的問(wèn)題。

2、第一方面，本發(fā)明提供基于雙向負(fù)載模塊的通用工程外泌體構(gòu)建方法，包括以下步驟：

3、步驟s1：構(gòu)建包括融合蛋白的編碼基因的質(zhì)粒表達(dá)載體；

4、所述融合蛋白包括：a：四次跨膜蛋白cd63，n端攜帶標(biāo)簽蛋白；b：插入至打開的四次跨膜蛋白cd63的第二胞外環(huán)中的catcher，所述catcher前后由柔性連接肽連接，c端攜帶標(biāo)簽蛋白；c：位于四次跨膜蛋白cd63的c端的結(jié)構(gòu)模塊，包括：（i）多聚堿性膜內(nèi)錨定結(jié)構(gòu)域；（ii）長(zhǎng)度為10-20個(gè)氨基酸的柔性連接肽；（iii）λ噬菌體來(lái)源的n-peptide結(jié)構(gòu)域；

5、步驟s2：所述質(zhì)粒表達(dá)載體包裝慢病毒并純化后導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)所述融合蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞株；

6、步驟s3：所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞株的培養(yǎng)液中通過(guò)離心法提取具備膜外展示catcher和膜內(nèi)富集rna能力的雙功能外泌體，所述外泌體膜外通過(guò)catcher與相應(yīng)tag標(biāo)記的功能分子形成異肽鍵，實(shí)現(xiàn)共價(jià)連接；所述外泌體膜內(nèi)通過(guò)n-peptide結(jié)構(gòu)域，富集攜帶boxb序列的目標(biāo)mrna分子。

7、進(jìn)一步地，步驟s1中，所述catcher包括snoopcatcher、spycatcher、dogcatcher或sdycatcher中的至少一種；所述λ噬菌體來(lái)源的n-peptide結(jié)構(gòu)域可替換為ms2噬菌體衣殼蛋白；

8、步驟s3中，所述boxb序列可替換為ms2?stem-loop序列。

9、進(jìn)一步地，步驟s1中，所述四次跨膜蛋白cd63的編碼基因序列如seq?id?no.1所示，所述snoopcatcher的編碼基因序列如seq?id?no.2所示，所述λ噬菌體來(lái)源的n-peptide結(jié)構(gòu)域的編碼基因如seq?id?no.3所示。

10、進(jìn)一步地，步驟s1中，所述多聚堿性膜內(nèi)錨定結(jié)構(gòu)域由精氨酸、脯氨酸和賴氨酸殘基組成，氨基酸序列如seq?id?no.4所示。

11、進(jìn)一步地，步驟s1中，所述四次跨膜蛋白cd63的n端攜帶flag標(biāo)簽蛋白，所述catcher的c端攜帶myc標(biāo)簽蛋白，所述柔性連接肽為(gly4ser)n，n=2-4。

12、進(jìn)一步地，步驟s2中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括hek293t細(xì)胞。

13、進(jìn)一步地，步驟s3中，所述相應(yīng)tag標(biāo)記的功能分子包括熒光標(biāo)記多肽、金納米簇、靶向肽、納米材料或信號(hào)探針；所述相應(yīng)tag標(biāo)記的功能分子與其所連接的藥物、蛋白或材料之間通過(guò)纈氨酸-瓜氨酸酸敏可裂解連接肽連接，所述連接肽在溶酶體環(huán)境下自發(fā)水解，實(shí)現(xiàn)遞送物質(zhì)的控釋釋放。

14、第二方面，本發(fā)明提供一種融合蛋白，包括：a：四次跨膜蛋白cd63，n端攜帶標(biāo)簽蛋白；b：插入至打開的四次跨膜蛋白cd63的第二胞外環(huán)的catcher，所述catcher前后由柔性連接肽連接，c端攜帶標(biāo)簽蛋白；c：位于四次跨膜蛋白cd63的c端的結(jié)構(gòu)模塊，包括：（i）由精氨酸、脯氨酸和賴氨酸殘基組成的多聚堿性膜內(nèi)錨定結(jié)構(gòu)域，氨基酸序列如seq?id?no.4所示；（ii）長(zhǎng)度為10-20個(gè)氨基酸的柔性連接肽；（iii）λ噬菌體來(lái)源的n-peptide結(jié)構(gòu)域。

15、第三方面，本發(fā)明提供基于雙向負(fù)載模塊的通用工程外泌體構(gòu)建方法構(gòu)建的質(zhì)粒表達(dá)載體、慢病毒或通用工程外泌體。

16、進(jìn)一步地，基于雙向負(fù)載模塊的通用工程外泌體構(gòu)建的質(zhì)粒表達(dá)載體、慢病毒或通用工程外泌體在腫瘤免疫治療、靶向藥物遞送、rna治療、疫苗載體或納米材料展示領(lǐng)域的應(yīng)用。

17、本發(fā)明具有如下有益效果：

18、（1）通過(guò)構(gòu)建基于雙向負(fù)載模塊的通用工程化外泌體，解決當(dāng)前外泌體修飾穩(wěn)定性差、共價(jià)修飾條件苛刻、反應(yīng)位點(diǎn)不確定等技術(shù)痛點(diǎn)，具有高度選擇性：膜外，catcher與tag配對(duì)專一；共價(jià)穩(wěn)定性強(qiáng)：異肽鍵連接不可逆；生物正交反應(yīng)：不干擾宿主體系，可在復(fù)雜生物環(huán)境中自發(fā)發(fā)生；組裝條件溫和：不依賴外源催化劑；模塊化擴(kuò)展性強(qiáng)：適配多種治療或診斷分子。膜內(nèi)，引入n-peptide/boxb系統(tǒng)，能夠在外泌體膜內(nèi)特異性地識(shí)別并高效富集帶有boxb序列的rna分子，從而突破了傳統(tǒng)外泌體核酸裝載效率低、缺乏針對(duì)性富集機(jī)制的技術(shù)瓶頸，進(jìn)一步提升外泌體核酸藥物遞送的精準(zhǔn)性與有效性，實(shí)現(xiàn)了對(duì)外泌體的雙向負(fù)載模塊化改造。

19、（2）通過(guò)工程化質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單而高效的模塊化外泌體工程修飾，可推廣至多種外泌體的應(yīng)用場(chǎng)景，包括腫瘤免疫治療、靶向藥物遞送、rna治療、疫苗載體或納米材料展示等領(lǐng)域。此外本構(gòu)建方法簡(jiǎn)單，通用性強(qiáng)，可適用于常見哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的工程化以產(chǎn)生相應(yīng)的工程化外泌體。使用者無(wú)需掌握任何分子克隆及基因工程技術(shù)，也無(wú)需相關(guān)背景知識(shí)，僅需直接使用本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)融合蛋白基因的慢病毒感染目標(biāo)細(xì)胞系，隨后以嘌呤霉素進(jìn)行篩選以獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，便可輕松完成目標(biāo)細(xì)胞系的工程化，隨后通過(guò)常規(guī)的外泌體提取方法便可直接獲得表達(dá)catcher和n-peptide的工程化外泌體，可便捷地與任何經(jīng)過(guò)相應(yīng)tag標(biāo)記材料進(jìn)行特異、高效、條件溫和的組裝，同時(shí)完成目的rna的高效富集攜帶。四次跨膜蛋白cd63作為外泌體的經(jīng)典表面標(biāo)志物，在hek293t、間充質(zhì)干細(xì)胞等多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中廣泛表達(dá)，以四次跨膜蛋白cd63作為外泌體膜錨定框架可直接推廣至不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體工程化修飾，無(wú)需針對(duì)特定細(xì)胞優(yōu)化設(shè)計(jì)，構(gòu)建方法通用性強(qiáng)。

20、（3）通過(guò)四次跨膜蛋白cd63作為外泌體膜錨定框架，在四次跨膜蛋白cd63第二胞外環(huán)插入catcher并引入柔性連接肽，保留四次跨膜蛋白cd63整體構(gòu)象，可在基本不擾動(dòng)整體折疊的情況下同時(shí)展示膜外catcher與膜內(nèi)?n-peptide。為進(jìn)一步穩(wěn)固內(nèi)外雙模塊結(jié)構(gòu)，本發(fā)明在融合蛋白c端特別加入由精氨酸-賴氨酸為主、間隔1-2個(gè)脯氨酸折角的多聚堿性膜內(nèi)錨定結(jié)構(gòu)域，構(gòu)成可調(diào)長(zhǎng)度的“拓?fù)滏i”。該結(jié)構(gòu)域以精氨酸為核心，富含胍基型正電荷，可與外泌體膜內(nèi)側(cè)磷脂的負(fù)電荷頭部形成多位點(diǎn)、高強(qiáng)度的靜電相互作用，同時(shí)插入的脯氨酸打斷長(zhǎng)直鏈以降低二級(jí)結(jié)構(gòu)傾向，形成柔性而高電荷密度的尾巴，提高膜內(nèi)側(cè)親和力。上述結(jié)構(gòu)可有效降低在大量末端結(jié)構(gòu)改造后可能出現(xiàn)的膜定位紊亂或跨膜段翻轉(zhuǎn)風(fēng)險(xiǎn)，從而保持融合蛋白正確的跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。同時(shí)，該結(jié)構(gòu)域與n-peptide結(jié)構(gòu)域（rna結(jié)合模塊）形成協(xié)同機(jī)制：其強(qiáng)正電特性通過(guò)電荷梯度效應(yīng)主動(dòng)將帶負(fù)電的mrna拖拽至n-peptide鄰域，配合n-peptide對(duì)boxb序列的特異性結(jié)合，形成“吸附-鉤鎖”式雙重固定，既借助精氨酸胍基與rna磷酸骨架的高效靜電作用實(shí)現(xiàn)mrna的二次凝聚，又通過(guò)柔性結(jié)構(gòu)避免對(duì)n-peptide特異性識(shí)別的空間干擾，顯著提升外泌體內(nèi)mrna的裝載量與穩(wěn)定性。上述協(xié)同設(shè)計(jì)預(yù)計(jì)能夠提高外泌體內(nèi)?rna裝載量與穩(wěn)定性，并確保膜外catcher與膜內(nèi)n-peptide的空間定位精確且功能互不干擾，從而整體增強(qiáng)工程化外泌體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與遞送效果。