本發(fā)明涉及生物，具體而言，涉及基于重組鵝圓環(huán)病毒cap蛋白的單克隆抗體的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、鵝圓環(huán)病毒（goose?circovirus，gocv）是一組具有環(huán)狀dna基因組的小病毒，不同天齡、品種和性別的鵝均可受到感染。感染鵝主要表現(xiàn)為羽毛紊亂和生長(zhǎng)發(fā)育遲緩等非典型臨床癥狀，人們?cè)谧匀桓腥静±泻茈y注意到gocv單一感染的病例。事實(shí)上，家鵝感染gocv被認(rèn)為能夠引起免疫抑制，降低其它疫苗免疫保護(hù)效果的同時(shí)促進(jìn)其它病原體的繼發(fā)感染。本技術(shù)通過(guò)大腸桿菌外源表達(dá)鵝圓環(huán)病毒結(jié)構(gòu)蛋白cap為免疫原，免疫balb/c小鼠，并進(jìn)行elisa鑒定血清效價(jià)達(dá)1：12800以上的小鼠，采集脾細(xì)胞與sp2/0細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，通過(guò)elisa、wb以及ifa方法篩選陽(yáng)性融合細(xì)胞株，通過(guò)三次亞克隆，成功篩選融合細(xì)胞株2株，分別命名為b2和c7。通過(guò)對(duì)單克隆抗體進(jìn)行亞類(lèi)鑒定，發(fā)現(xiàn)b2株及c7株重鏈均為igg2b，輕鏈均為kappa。利用balb/c小鼠制備腹水，腹水經(jīng)過(guò)proteina/g純化后得到純化的單克隆抗體，可以為后續(xù)開(kāi)發(fā)膠體金研發(fā)試紙條、雙抗夾心elisa和ifa等檢測(cè)方法打下基礎(chǔ)。

2、目前對(duì)于鵝圓環(huán)病毒的檢測(cè)主要為pcr、qpcr、elisa等實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，技術(shù)繁瑣，時(shí)間較長(zhǎng)，并不能夠在現(xiàn)場(chǎng)快速的給出診斷結(jié)果，鵝圓環(huán)因?yàn)樵谂R床上的癥狀表現(xiàn)不典型，不會(huì)造成明顯的死亡，因此需要開(kāi)發(fā)一種現(xiàn)場(chǎng)在不傷害鵝身體狀況的前提下，能檢測(cè)出鵝圓環(huán)病毒的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法，膠體金法。本技術(shù)開(kāi)發(fā)的單克隆抗體能夠?yàn)楹罄m(xù)開(kāi)發(fā)膠體金法、雙抗夾心elisa及ifa等檢測(cè)方法提供基礎(chǔ)，并且能夠?yàn)楹罄m(xù)研發(fā)治療制劑提供材料。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于此，為了解決上述問(wèn)題之一，本發(fā)明提供了基于重組鵝圓環(huán)病毒cap蛋白的單克隆抗體的制備方法和應(yīng)用，具體技術(shù)方案如下：

2、基于重組鵝圓環(huán)病毒cap蛋白的單克隆抗體的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：

3、將pet-28a-cap質(zhì)粒使用熱激法轉(zhuǎn)化bl21進(jìn)行蛋白表達(dá)，經(jīng)過(guò)搖菌處理，誘導(dǎo)表達(dá)以及離心處理，得到菌體；

4、將所述菌體進(jìn)行破碎處理以及sds-page，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉過(guò)夜，洗滌處理以及純化處理，得到cap蛋白；

5、將所述cap蛋白與弗氏完全佐劑混合均勻進(jìn)行乳化，抗原劑量為100ug/只小鼠，第一次免疫，2周后將cap蛋白與弗氏不完全佐劑等劑量混勻后進(jìn)行乳化，進(jìn)行第二次免疫，抗原劑量為100ug/只小鼠，第二次免疫7天后，采集小鼠尾尖靜脈血建立elisa方法并進(jìn)行第三次免疫，第三次免疫7天后，采集小鼠尾尖血分離血清，進(jìn)行血清效價(jià)測(cè)定，血清效價(jià)達(dá)1：10000以上的進(jìn)行第四次腹腔沖擊免疫，抗原量為60ug，不加佐劑，再篩選免疫較好的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)，將hat培養(yǎng)基更換為ht培養(yǎng)基，待雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)至1/4培養(yǎng)孔面積時(shí)對(duì)其進(jìn)行elisa篩選；對(duì)有雜交瘤細(xì)胞的細(xì)胞孔進(jìn)行檢測(cè)，用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞亞克隆、擴(kuò)大及凍存，經(jīng)過(guò)三輪亞克隆后，克隆出單克隆細(xì)胞株，用無(wú)血清培養(yǎng)和單克隆細(xì)胞株，收集培養(yǎng)上清。

6、進(jìn)一步地，所述cap蛋白氨基酸序列如seqidno.1所示。

7、進(jìn)一步地，將實(shí)驗(yàn)室保存的pet-28a-cap質(zhì)粒使用熱激法轉(zhuǎn)化bl21進(jìn)行蛋白表達(dá)，在37℃條件下，搖菌達(dá)到od600值為0.6~0.8時(shí)，加入0.5mmol/l的iptg進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)6h，隨后離心處理，得到菌體。

8、進(jìn)一步地，將菌體中加入pbs進(jìn)行重懸，利用超聲波破碎儀，于400w、破5s停5s的條件下破碎處理10min，然后將全菌液加入5×sds-page上樣緩沖液，煮沸10min進(jìn)行sds-page，后在0.3a，25v的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜15min，5%脫脂奶粉封閉4℃過(guò)夜，pbst洗5次，每次5min，再純化處理，得到cap蛋白。

9、進(jìn)一步地，所述純化處理為：將洗滌處理后的包涵體蛋白樣品500μl，經(jīng)5xsds-page上樣液處理制樣；

10、然后按照sds-page凝膠配置試劑盒分別配置12%的分離膠和5%的濃縮膠，但是在注入濃縮膠時(shí)留出上樣空間，不插樣品梳，用甲醇?jí)壕€，再按照常規(guī)的方法sds-page電泳，結(jié)束后，取下蛋白膠放于干凈的大平皿中，加入適量kcl染液，常溫靜置染色5min；

11、用解剖刀切下染成銀白色的目的條帶，置于另一干凈平皿中，用pbs清洗3遍；

12、將清洗后的膠塊置于研缽中，加入液氮，研磨至粉末狀；

13、將研磨后的粉末置于新的2mlep管中，加入適量pbs混勻，于4℃條件下靜置過(guò)夜，然后于4℃，12000rpm的條件下離心5min，收集上清液，通過(guò)超濾管進(jìn)行濃縮，得到純化處理的cap蛋白。

14、進(jìn)一步地，所述第一次免疫、所述第二次免疫以及所述第三次免疫均采用腹腔注射的方式，且所述第三次免疫與所述第二次免疫的方法和劑量相同。

15、進(jìn)一步地，血清效價(jià)測(cè)定為：將純化的cap蛋白用包被液稀釋到8ug/ml，100μl/孔的劑量包被進(jìn)96孔酶標(biāo)板中，4℃包被過(guò)夜，然后用pbst洗5遍，300μl/孔，甩干，再用5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉，300μl/孔，4℃封閉6h，封閉結(jié)束再次用pbst洗滌5次，甩干；

16、將陰性血清、陽(yáng)性血清分別按1:200稀釋?zhuān)謩e加入對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)孔內(nèi)，37℃孵育1h，pbst洗滌5次，甩干；

17、將二抗按1:10000稀釋?zhuān)?00μl/孔，37℃孵育30min，pbst洗滌5次，甩干；

18、加底物顯色液100μl/孔，37℃避光顯色10min，加入elisa終止液50μl/孔，測(cè)量od450nm值，在15min內(nèi)完成讀數(shù)；

19、判斷標(biāo)準(zhǔn)：p/n值≥2.1判定為陽(yáng)性。

20、另外，本發(fā)明還提供所述的基于重組鵝圓環(huán)病毒cap蛋白的單克隆抗體在制備鵝圓環(huán)病毒的診斷試劑中的應(yīng)用。

21、本發(fā)明還提供基于重組鵝圓環(huán)病毒cap蛋白的單克隆抗體在制備鵝圓環(huán)病毒疫苗中應(yīng)用。

22、本發(fā)明還提供基于重組鵝圓環(huán)病毒cap蛋白的單克隆抗體在非治療目的中和病毒活性以及被動(dòng)免疫活動(dòng)中的應(yīng)用。

23、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

24、本發(fā)明提供基于重組鵝圓環(huán)病毒cap蛋白，制備單克隆抗體具有優(yōu)異的特異性和親和力，并與鵝圓環(huán)病毒有優(yōu)異的反應(yīng)性，且應(yīng)用于診斷試劑的制備中，也具有較高的特異性和靈敏度。另外，將制備的單克隆抗體應(yīng)用在非治療目的中和病毒活性以及被動(dòng)免疫活動(dòng)中，單克隆體能通過(guò)結(jié)合病毒關(guān)鍵蛋白（cap蛋白），阻斷其感染機(jī)制；抗體靶向病毒衣殼蛋白的中和表位，可阻止病毒吸附宿主細(xì)胞，抑制病毒復(fù)制；直接注射單克隆抗體能提供即時(shí)的免疫保護(hù)；制備的單克隆抗體還能與與病毒蛋白的相互作用分析，可精準(zhǔn)定位中和表位，指導(dǎo)疫苗設(shè)計(jì)，用于疫苗免疫后抗體水平的定量檢測(cè)，評(píng)估免疫效果，并對(duì)病毒的診斷、病情的評(píng)估具有重要意義。