背景技術(shù)：

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、因此，需要用于對組織(諸如眼部組織和眼周組織)進行成像以及操縱的改進的且有用的方法和系統(tǒng)，包括需要用于遞送皮膚病學(xué)治療或療法和美容治療或療法的改進的技術(shù)。具體地，與通過現(xiàn)有技術(shù)可獲得的相比，需要通過非透明組織對組織(諸如眼部組織和眼周組織)進行更深入的成像以及操縱。還需要使用除了基于熱的治療之外的技術(shù)來操縱組織，包括更深地進入組織，諸如提供或應(yīng)用非切口療法、光-組織相互作用、激光-組織相互作用、激光-組織擾動、光致破裂(photo-disruption)、血管凝固、消融等。還需要以比現(xiàn)有的基于熱的治療更大的準確性和更大的精度來遞送基于熱的治療，諸如應(yīng)用多光子介導(dǎo)的熱損傷。本發(fā)明提供了此類新的且有用的方法和系統(tǒng)，解決了上述局限性。為了實現(xiàn)這一點，本發(fā)明利用多光子顯微術(shù)，包括下一代技術(shù)，諸如三光子激發(fā)熒光(3pef)顯微術(shù)、二次諧波生成(2hg)和三次諧波生成(3hg)，以便對結(jié)構(gòu)進行成像，以及利用多光子組織相互作用以操縱結(jié)構(gòu)，在每種情況下都穿過非透明組織(諸如眼部組織或眼周組織)，從而接近先前使用現(xiàn)有技術(shù)無法接近的更深的結(jié)構(gòu)和周邊結(jié)構(gòu)，或者以比現(xiàn)有技術(shù)更高的準確性或更精細的粒度接近該更深的結(jié)構(gòu)和周邊結(jié)構(gòu)。

2、本發(fā)明的實施方案能夠?qū)⑷魏畏奖愕慕Y(jié)構(gòu)，諸如眼部結(jié)構(gòu)和眼周結(jié)構(gòu)，包括前部結(jié)構(gòu)和表面結(jié)構(gòu)以及深部結(jié)構(gòu)和周邊結(jié)構(gòu)，諸如眼部結(jié)構(gòu)，諸如脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)、視網(wǎng)膜色素上皮和睫狀體可視化，在每種情況下都具有精美的細胞細節(jié)。據(jù)發(fā)明人所知，本發(fā)明首次成功地采用此類光學(xué)技術(shù)將活體眼睛中的周邊眼部結(jié)構(gòu)(諸如例如睫狀體)可視化，并提供更深的眼部結(jié)構(gòu)的此類高分辨率。與現(xiàn)有方法不同，本發(fā)明的實施方案不需要依賴于經(jīng)瞳孔的方法。本發(fā)明的實施方案提供了一種成像工具，用于以高分辨率將諸如眼部結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)可視化，包括先前通過光學(xué)方法無法接近的眼內(nèi)結(jié)構(gòu)，包括睫狀體、周邊視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜，并且這可以通過細胞分辨率和功能成像能力來實現(xiàn)。此外，本發(fā)明的實施方案提供了用于研究活體眼睛和眶骨膜中的細胞和分子生物學(xué)的工具。本發(fā)明的實施方案提供了用于輔助診斷疾病，諸如輔助診斷癌性組織的技術(shù)。本發(fā)明的實施方案提供了用于治療某些病狀的技術(shù)，諸如分解阻塞淚腺并引起干眼癥癥狀的凝固流體。本發(fā)明的實施方案提供了用于皮膚病學(xué)應(yīng)用的技術(shù)，諸如執(zhí)行活檢程序或其它手術(shù)或疤痕治療。本發(fā)明的實施方案提供了用于美容應(yīng)用的技術(shù)，諸如操縱脂肪沉積物(諸如眼睛周圍的脂肪沉積物)的形狀或體積。

3、背景信息，包括關(guān)于雙光子顯微術(shù)的各方面的背景信息，在以下文獻中提供：helmchen,f.和w.denk，“深組織雙光子顯微術(shù)(deep?tissue?two-photon?microscopy)”，《自然方法(nat?methods)》，2005.2(12):第932-40頁，以及zipfel,w.r.,r.m.williams和w.w.webb,“非線性魔法：生物科學(xué)中的多光子顯微術(shù)(nonlinear?magic:multiphotonmicroscopyin?the?biosciences)”，《自然生物技術(shù)(nat?biotechnol)》，2003.21(11):第1369-77頁，其公開內(nèi)容以其整體并入本文。通常，多光子成像的深度固有地被限制為組織內(nèi)激發(fā)波長的衰減距離的大約五倍，并且穿過高度散射和吸收性組織(例如，骨或鞏膜)成像是具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。因此，3pef成像和其它更高階的技術(shù)能夠?qū)Ω畹慕M織進行成像以及操縱。背景信息，包括關(guān)于三光子顯微術(shù)的各方面的背景信息，在以下文獻中提供：wang?t等人，“通過完整顱骨對小鼠腦結(jié)構(gòu)和功能的三光子成像(three-photon?imagingof?mouse?brain?structure?and?function?through?the?intact?skull)”，《自然方法》，2018年10月；15(10):789-792.doi:10.1038/s41592-018-0115-y.電子出版2018年9月10日，pmid:30202059；pmcid:pmc6188644，以及cheng?yt,lett?km,schaffer?cb.“用于小鼠脊髓中的細胞分辨的體內(nèi)成像的手術(shù)準備、標記策略和光學(xué)技術(shù)(surgicalpreparations,labeling?strategies,and?opticaltechniques?for?cell-resolved,in?vivo?imaginginthe?mouse?spinal?cord)”，《實驗神經(jīng)學(xué)(exp?neurol.)》，2019年8月；318:192-204.doi:10.1016/j.expneurol.2019.05.010.電子出版2019年5月13日，pmid:31095935；pmcid:pmc6588420，其公開內(nèi)容以其整體并入本文。背景信息，包括關(guān)于使用二次諧波生成獲得的成像結(jié)果的背景信息，在以下文獻中提供：campagnola?pj,loew?lm.“用于可視化細胞、組織和有機體中的生物分子陣列的二次諧波成像顯微術(shù)(second-harmonic?imagingmicroscopy?for?visualizing?biomolecular?arrays?in?cells,tissues?andorganisms)”，《自然生物技術(shù)》，2003年11月；21(11):1356-60.doi:10.1038/nbt894.pmid:14595363。

4、此外，本發(fā)明的實施方案提供了一種非切口療法工具，用于先前不可能或限于切口療法的各種應(yīng)用，諸如例如：(i)用于睫狀體的精確的和細胞靶向的光致凝固和/或組織破裂，以可控地且安全地減少眼睛的房水產(chǎn)生，用于治療青光眼；(ii)用于進行經(jīng)鞏膜激光小梁切開術(shù)和/或小梁成形術(shù)和/或鞏膜切開術(shù)，以增加房水通過常規(guī)引流途徑的流出，用于治療青光眼；(iii)用于識別周邊視網(wǎng)膜撕裂或不規(guī)則性并為其提供光致凝固療法，用于治療和預(yù)防視網(wǎng)膜脫離；(v)用于識別睫狀體腫瘤和周邊脈絡(luò)膜腫瘤并為其提供光致凝固和熱治療；(vii)用于鞏膜組織的光致交聯(lián)以用于預(yù)防近視；(viii)用于識別和進行眼外肌功能的靶向改變；(ix)和眼眶脂肪的可視化和靶向的熱療法和光致凝固療法；(x)皮膚病學(xué)應(yīng)用，諸如對皮膚組織進行成像、區(qū)分癌性組織和非癌性組織、診斷黑色素瘤、對癌性組織(諸如黑色素瘤)進行消融或以其它方式破壞該癌性組織，進行皮膚活檢手術(shù)或其它皮膚病學(xué)程序和應(yīng)用；或(xi)美容應(yīng)用，諸如影響組織內(nèi)脂肪沉積物的形狀或體積，影響皮膚的外觀，例如皮膚緊致，或皮膚的顏色，例如去除變色或疤痕或紋身，或其它美容應(yīng)用。本發(fā)明的實施方案提供了一種工具，該工具通過能夠?qū)崿F(xiàn)對先前無法接近的結(jié)構(gòu)的高分辨率成像而用于藥物或細胞或基因遞送，以用于精確定位(例如，在眼部組織或眼周組織內(nèi))以用于遞送此類藥物或細胞或基因等。

5、如上所述，眼睛中的光學(xué)成像對于眼科護理至關(guān)重要，并且也是用于評價全身健康和疾病的有力方法。例如，捕捉指示神經(jīng)血管視網(wǎng)膜中的細微變化的圖像可以被分析，以提供對從心血管健康到代謝紊亂范圍的眼部狀況和全身狀況的準確洞察。然而，用于通過瞳孔成像的常規(guī)方法僅提供有限的視網(wǎng)膜視圖，并且許多關(guān)鍵的眼內(nèi)結(jié)構(gòu)被非透明和嚴重著色的組織遮蔽。例如，常規(guī)的光學(xué)成像僅提供了視網(wǎng)膜的有限視圖，并且大多數(shù)眼內(nèi)組織，諸如睫狀體、脈絡(luò)膜、周邊視網(wǎng)膜和周邊視網(wǎng)膜色素上皮(rpe)，是無法觸及的或不能被充分可視化。這些隱蔽的區(qū)域在眼部疾病的發(fā)展和進展中起著關(guān)鍵作用，例如，睫狀體產(chǎn)生眼睛的房水并嚴格調(diào)節(jié)青光眼的病理生理學(xué)，并且脈絡(luò)膜是高度血管化的組織，其支持光感受器、rpe并在眼中提供免疫監(jiān)視，并且脈絡(luò)膜的變化可以反映全身狀況，包括自身免疫性疾病、轉(zhuǎn)移性癌癥、全身性感染、血液學(xué)病癥、高血壓和糖尿病。利用多光子顯微術(shù)的本發(fā)明的實施方案能夠以亞細胞分辨率進行深度成像，包括關(guān)于此類區(qū)域的深度成像。進一步利用自適應(yīng)光學(xué)和激光技術(shù)的本發(fā)明的實施方案使得諸如三光子激發(fā)熒光和三次諧波生成的更高階非線性過程能夠被進一步產(chǎn)生到高度散射的組織中，包括此類區(qū)域，或者例如直接穿過小鼠顱骨或者直接穿過眼睛的非透明鞏膜壁。

6、包括被配置用于諸如三光子激發(fā)熒光(3pef)和三次諧波生成(thg)的更高階非線性過程的激光源的實施方案允許更深的成像。它們較長的激發(fā)波長具有顯著較少的散射和光毒性，導(dǎo)致更大的穿透和通過完整顱骨的成像。當與靜脈內(nèi)注射熒光染料結(jié)合時，利用3pef的實施方案提供了出色的血管成像，并且利用thg的實施方案提供了包括血管在內(nèi)的組織的無標記對比。在眼部組織中，利用thg的實施方案可以被配置為使內(nèi)核層、外核層、神經(jīng)節(jié)細胞層和視網(wǎng)膜色素上皮可視化。參見rim,t.h.等人，“從視網(wǎng)膜照片預(yù)測系統(tǒng)生物標志物：深度學(xué)習算法的開發(fā)和驗證(prediction?of?systemic?biomarkers?from?retinalphotographs:development?and?validation?of?deep-learning?algorithms)”，《柳葉刀數(shù)字健康(lancet?digit?health)》，2020.2(10):第e526-e536頁；wagner,s.k.等人，“通過基于視網(wǎng)膜成像的眼組學(xué)洞察系統(tǒng)性疾病(insights?into?systemic?disease?throughretinal?imaging-based?oculomics)”，《轉(zhuǎn)化視覺科學(xué)與技術(shù)(transl?vis?scitechnol)》，2020.9(2):第6頁；poplin,r.等人，“經(jīng)由深度學(xué)習從視網(wǎng)膜眼底照片預(yù)測心血管危險因素(prediction?of?cardiovascular?risk?factors?from?retinal?fundusphotographs?via?deep?learning)”，《國家生物醫(yī)學(xué)工程(nat?biomed?eng)》，2018.2(3):第158-164頁；anand,n.等人，“用于治療青光眼的睫狀體破壞術(shù)的綜述(areview?ofcyclodestructive?procedures?for?the?treatment?of?glaucoma)”，《眼科研討會(seminophthalmol)》，2020.35(5-6)：第261-275頁；kiel,j.w.和h.a.reitsamer，“睫狀血流和房水產(chǎn)生之間的關(guān)系：它在青光眼療法中起作用嗎？(relationship?between?ciliary?bloodflow?and?aqueous?production:does?it?play?a?role?in?glaucoma?therapy？)”，《青光眼雜志(j?glaucoma)》，2006.15(2):第172-81頁；nickla,d.l.和j.wallman，“多功能脈絡(luò)膜(the?multifunctional?choroid)”，《視網(wǎng)膜和眼睛研究進展(prog?retin?eye?res)》，2010.29(2)：第144-68頁；kongwattananon,w.,t.pothikamjorn和t.somkijrungroj，“眼部轉(zhuǎn)移瘤的后段表現(xiàn)(posterior?segment?manifestations?of?ocular?metastasis)”，《眼科最新觀點(curr?opin?ophthalmol)》，2023；nowinska,a.k.等人，“系統(tǒng)性疾病的眼部表現(xiàn)(ocular?manifestations?of?systemic?diseases)”，《眼科學(xué)雜志(jophthalmol)》，2018.2018:第7851691頁；helmchen,f.和w.denk，“深層組織雙光子顯微術(shù)”，《自然方法》，2005.2(12):第932-40頁；zipfel,w.r.,r.m.williams和w.w.webb，“非線性魔法：生物科學(xué)中的多光子顯微術(shù)”，《自然生物技術(shù)》，2003.21(11):第1369-77頁；wang,t.等人，“通過完整顱骨對小鼠大腦結(jié)構(gòu)和功能的三光子成像”，《自然方法》，2018.15(10):第789-792頁；ouzounov,d.g.等人，“完整小鼠腦深部gcamp6標記的神經(jīng)元的活動的體內(nèi)三光子成像(invivo?three-photon?imaging?of?activity?of?gcamp6-labeled?neurons?deep?inintact?mouse?brain)”，《自然方法》，2017.14(4):第388-390頁；yildirim,m.等人，“用優(yōu)化的三光子顯微術(shù)對清醒小鼠的視覺皮層和亞板進行功能成像(functional?imaging?ofvisual?cortical?layers?and?subplate?in?awake?mice?with?optimized?three-photonmicroscopy)”，《自然通信(nat?commun)》，2019.10(1):第177頁；masihzadeh,o.等人，“小鼠視網(wǎng)膜的三次諧波生成顯微術(shù)(third?harmonic?generation?microscopy?of?a?mouseretina)”，《分子視覺(mol?vis)》，2015.21:第538-47頁；wu,j.等人，“體內(nèi)神經(jīng)活動的千赫茲雙光子熒光顯微術(shù)成像(kilohertz?two-photon?fluorescence?microscopy?imagingof?neural?activity?in?vivo)”，《自然方法》，2020.17(3):第287-290頁；kim,t.n.等人，“線掃描粒子圖像測速技術(shù)：一種用于量化活體動物的大范圍血流速度的光學(xué)方法(line-scanning?particle?image?velocimetry:an?optical?approach?for?quantifying?awide?range?of?blood?flow?speeds?in?live?animals)”，《公共科學(xué)圖書館·綜合(plosone)》,2012.7(6):第e38590頁；briers,j.d，“用于血液灌注繪圖和成像的激光多普勒、散斑和相關(guān)技術(shù)(laser?doppler,speckle?and?related?techniques?for?blood?perfusionmapping?and?imaging)”，《生理測量(physiol?meas)》，2001.22(4):第r35-66頁；hu,s.和l.v.wang，“微血管的光聲成像和表征(photoacoustic?imaging?and?characterizationof?the?microvasculature)”，《生物醫(yī)學(xué)光學(xué)雜志(j?biomed?opt)》，2010.15(1):第011101頁；meng,g.等人，“小鼠腦內(nèi)血液循環(huán)的超快雙光子熒光成像(ultrafast?two-photon?fluorescence?imaging?of?cerebral?blood?circulation?in?the?mouse?brainin?vivo)”，《美國國家科學(xué)院院刊(proc?natl?acad?sci?u?s?a)》，2022.119(23):第e2117346119頁；ji,n.，“自適應(yīng)光學(xué)熒光顯微術(shù)(adaptive?optical?fluorescencemicroscopy)”，《自然方法》，2017.14(4):第374-380頁；zhang,q.等人，“光學(xué)顯微術(shù)的自適應(yīng)光學(xué)(adaptive?optics?for?optical?microscopy)”[特邀]，《生物醫(yī)學(xué)光學(xué)快報(biomed?opt?express)》，2023.14(4):第1732-1756頁；wang,k.等人，“用于散射組織中高分辨率體內(nèi)成像的直接波前感測(direct?wavefront?sensing?for?high-resolution?invivo?imaging?in?scattering?tissue)”，《自然通信》，2015.6:第7276頁；rodriguez,c.等人，“用于體內(nèi)深層組織多光子成像的自適應(yīng)光學(xué)模塊(an?adaptive?optics?module?fordeep?tissue?multiphoton?imaging?in?vivo)”，《自然方法》，2021.18(10):第1259-1264頁；wang,c.等人，“用于體內(nèi)深層組織成像的多重像差測量(multiplexed?aberrationmeasurement?for?deep?tissue?imaging?in?vivo)”，《自然方法》，2014.11(10):第1037-40頁；jung,s.等人，“通過靶向缺失和綠色熒光蛋白報告基因插入分析分形趨化因子受體cx(3)cr1功能(analysis?of?fractalkine?receptor?cx(3)cr1?function?by?targeteddeletion?and?green?fluorescent?protein?reporter?gene?insertion)”，《分子和細胞生物學(xué)(mol?cell?biol)》，2000.20(11):第4106-14頁；kang?i,z.q.,yu?sx和ji?n,“寬視場顯微術(shù)中計算自適應(yīng)光學(xué)的基于坐標的神經(jīng)表示(coordinate-based?neuralrepresentations?for?computational?adaptive?optics?in?widefield?microscopy)”，《生物學(xué)預(yù)印本資料庫(biorxiv)》,2023，其通過引用并入本文。

7、提供了用于對非透明組織(諸如眼部組織和眼周組織)進行多光子成像和與該非透明組織進行激光-組織相互作用的方法、系統(tǒng)和適配器。本發(fā)明的各方面包括通過非透明組織(諸如眼部組織或眼周組織)對結(jié)構(gòu)進行成像的方法，該方法包括：部署激發(fā)源以通過非透明組織(諸如眼部組織或眼周組織)將光能傳輸?shù)浇Y(jié)構(gòu)，檢測通過非透明組織(諸如眼部組織或眼周組織)經(jīng)由多光子激發(fā)從結(jié)構(gòu)發(fā)射的光，以及基于所檢測到的光對結(jié)構(gòu)進行成像。本發(fā)明的各方面進一步包括通過操縱經(jīng)成像的結(jié)構(gòu)來治療組織諸如眼部組織或眼周組織或皮膚組織的方法，包括例如提供非切口療法、光-組織相互作用、多光子介導(dǎo)的損傷，諸如熱損傷、光致破裂、光致交聯(lián)、血管凝固或?qū)M織進行消融。本發(fā)明的各方面進一步包括對皮膚組織進行成像或提供皮膚病學(xué)治療的方法。本發(fā)明的各方面進一步包括提供美容治療的方法。本發(fā)明的各方面進一步包括在眼部組織或眼周組織中引導(dǎo)基因療法或細胞療法的遞送的方法。還提供了用于執(zhí)行本文描述的方法的系統(tǒng)和適配器。