本發(fā)明屬于植物基因工程，涉及ghglk1蛋白及其編碼基因在調(diào)控棉花愈傷生長和分化中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、轉(zhuǎn)基因技術(shù)是通過現(xiàn)代科技手段，將具有高產(chǎn)、抗逆、抗病蟲、營養(yǎng)品質(zhì)提高等已知功能性狀的基因轉(zhuǎn)移到目標(biāo)生物體內(nèi)，使受體生物體在原有遺傳特性的基礎(chǔ)上增加新的功能特性，獲得新品種。一般來說，影響基因受體選擇的因素包括基因轉(zhuǎn)化方式、受體再生能力、受體物質(zhì)的生理狀態(tài)和再生途徑以及體細(xì)胞克隆變異的發(fā)生，其中限制基因轉(zhuǎn)移的主要因素是受體的再生能力，因?yàn)楦哳l植物再生系統(tǒng)的建立是植物基因轉(zhuǎn)化的重要條件。許多轉(zhuǎn)基因作物是通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化、植物再生生產(chǎn)的，這是一個耗時且高度依賴基因型的過程。隨著對轉(zhuǎn)化過程的探索，研究人員發(fā)現(xiàn)，植物中有一類基因可以在轉(zhuǎn)化過程中促進(jìn)植物再生，提高植物轉(zhuǎn)化效率，通過對這些基因的調(diào)控，可以獲得遺傳轉(zhuǎn)化效率高的材料，這對于加速植物轉(zhuǎn)化具有重要意義。

2、近年來報(bào)道了通過在愈傷組織或外植體過表達(dá)一些植物發(fā)育調(diào)節(jié)因子或復(fù)合體，如 wus/bbm， grf/gif， wox5等可以促進(jìn)植物體細(xì)胞胚的產(chǎn)生或芽的再生，從而提高基因轉(zhuǎn)化效率。golden2（g2）是garp轉(zhuǎn)錄因子超家族中的一員，其調(diào)控葉綠體的發(fā)育，還參與組織再生、生物脅迫、植物衰老、植物激素信號傳導(dǎo)等生物學(xué)過程。前人在研究中，對玉米g2基因進(jìn)行水稻密碼子優(yōu)化合成了 rzmg2基因，并從水稻中分離鑒定到愈傷特異強(qiáng)啟動子csppro（callus-specific?promoter），構(gòu)建了csppro驅(qū)動 rzmg2基因的雙元載體pyltac380h-csppro::rzmg2。將此載體轉(zhuǎn)化粳稻（dongjing和中嘉8號）、秈稻（華占和華光）以及玉米（b104）。在愈傷分化階段，轉(zhuǎn)化 rzmg2基因的水稻和玉米愈傷組織會提前轉(zhuǎn)綠且綠點(diǎn)變多，分化效率提高11.6-48.7%，轉(zhuǎn)化效率提高8.3-23%。研究者通過對水稻愈傷組織的rna-seq和rt-qpcr分析發(fā)現(xiàn)， rzmg2主要通過促進(jìn)葉綠體發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)來提高水稻的分化效率。

3、本發(fā)明技術(shù)人員在棉花中分離到一個功能基因 ghglk1，通過同源比對，發(fā)現(xiàn)棉花中的 ghglk1與玉米中再生相關(guān)基因 zmgolden2具有較高的同源性，通過構(gòu)建進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)兩者具有較近的親緣關(guān)系。然而，在棉花中，此前未見明確的研究報(bào)道和功能驗(yàn)證 ghglk1基因，其是否具有調(diào)控愈傷生長和分化的功能尚未可知。因?yàn)楝F(xiàn)有技術(shù)雖證明 zmgolden2在單子葉植物（水稻/玉米）中通過促進(jìn)葉綠體發(fā)育提升分化效率，但棉花是單子葉植物，其愈傷生長與分化的分子機(jī)制可能完全不同。另一方面，棉花為異源四倍體（atdt基因組）， ghglk1在at和dt亞基因組中存在功能冗余的拷貝，而玉米 zmgolden2為單拷貝基因?？缥锓N應(yīng)用時，同源基因在多倍體中的功能冗余性/特異性無法通過序列同源性推斷。而且不同植物中的 glk1所起的作用并不完全相同。例如：擬南芥中 glk1基因與抗生物脅迫和抗非生物脅迫相關(guān)，如 atglk1可增強(qiáng)對黃瓜花葉病毒（cmv）抗性， atglk通過調(diào)控aba響應(yīng)基因（如wrky40）參與干旱響應(yīng)等。番茄中 glk1基因與調(diào)控果實(shí)品質(zhì)相關(guān)。由此可知，蛋白glk1并非僅具有調(diào)控植物愈傷生長和分化的功能，顯然調(diào)控植物愈傷生長和分化的功能與蛋白glk1并不存在唯一對應(yīng)的關(guān)系?；诖耍绢I(lǐng)域技術(shù)人員無法將 ghglk1基因與調(diào)控植物愈傷生長和分化的功能直接相關(guān)聯(lián)，還需進(jìn)一步的研究。

4、同時，蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的氨基酸序列是其空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，而蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)又是其功能的基礎(chǔ)，同源性較高的蛋白質(zhì)是否具有相似的空間結(jié)構(gòu)和相似的功能，主要取決于那些在維系其空間結(jié)構(gòu)以及功能、活性中其關(guān)鍵作用的氨基酸殘基的差異，以及這些差異是否足以改變其空間構(gòu)象和相應(yīng)的生物學(xué)功能及活性，如果蛋白質(zhì)氨基酸序列中的一些甚至一個起關(guān)鍵作用的氨基酸改變，就會導(dǎo)致蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性或功能的極大變化?，F(xiàn)有大量文獻(xiàn)報(bào)道表明，基因中一個堿基的變化都可能導(dǎo)致表型的明顯變化（jiaoy,?wang?y,?xue?d,?wang?j,?yan?m,?liu?g,?dong?g,?zeng?d,?lu?z,?zhu?x,?qian?q,li?j.?regulation?of?osspl14?by?osmir156?defines?ideal?plant?architecture?inrice.?nat?genet.?2010?jun;42(6):541-4；peng?lm,?chen?xp,?sun?j,?guo?yj,?li?l,mo?l,?xie?w,?li?yj,?yang?tl,?li?cc.?influence?of?aldh2?glu504lys?polymorphismon?nitroglycerin?response?in?chronic?heart?failure?and?involvement?ofcalcitonin?gene?related?peptide?(cgrp).?int?j?clin?pharmacol?ther.?2012?oct;50(10):701-11；kobayashi?y,?kuroda?k,?kimura?k,?southron-francis?jl,?furuzawaa,?kimura?k,?iuchi?s,?kobayashi?m,?taylor?gj,?koyama?h.?amino?acidpolymorphisms?in?strictly?conserved?domains?of?a?p-type?atpase?hma5?areinvolved?in?the?mechanism?of?copper?tolerance?variation?in?arabidopsis.?plantphysiol.?2008?oct;148(2):969-80）。

5、綜上所述，在棉花 ghglk1基因是否具有調(diào)控愈傷生長和分化的功能，尚待研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何利用上述ghglk1及其編碼基因調(diào)控棉花的愈傷生長和分化。

2、為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明第一方面提供了提高蛋白質(zhì)含量和/或活性的應(yīng)用，所述應(yīng)用為下述任一種：

4、a1）在提高棉花愈傷組織生長或分化中的應(yīng)用；

5、a2）在縮短轉(zhuǎn)基因棉花培育周期中的應(yīng)用；

6、所述蛋白質(zhì)名稱為ghglk1，滿足以下條件：

7、b1）氨基酸序列是seq?id?no?.1的蛋白質(zhì)；

8、b2）在b1）的n端和/或c端連接標(biāo)簽得到的具有相同功能的融合蛋白質(zhì)。

9、上述應(yīng)用中，所述蛋白質(zhì)ghglk1可來源于棉花。

10、進(jìn)一步地，所述蛋白質(zhì)ghglk1可為棉花愈傷組織生長或分化相關(guān)蛋白ghglk1。

11、為了使b1）中的蛋白質(zhì)便于純化或檢測，可在由序列表中seq?id?no?.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接標(biāo)簽蛋白。

12、所述標(biāo)簽蛋白包括但不限于：gst(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶)標(biāo)簽蛋白、his6標(biāo)簽蛋白(his-tag)、mbp(麥芽糖結(jié)合蛋白)標(biāo)簽蛋白、flag標(biāo)簽蛋白、sumo標(biāo)簽蛋白、ha標(biāo)簽蛋白、myc標(biāo)簽蛋白、egfp(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)、ecfp(增強(qiáng)型青色熒光蛋白)、eyfp(增強(qiáng)型黃綠色熒光蛋白)、mcherry(單體紅色熒光蛋白)或avitag標(biāo)簽蛋白。

13、本發(fā)明第二方面提供了與所述與所述蛋白質(zhì)ghglk1相關(guān)的生物材料的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為下述任一種：

14、d1）在提高棉花愈傷組織生長或分化中的應(yīng)用；

15、d2）在縮短轉(zhuǎn)基因棉花培育周期中的應(yīng)用；

16、所述生物材料為下述e1）至e7）中的任一種：

17、e1）促進(jìn)或提高權(quán)利要求1中所述蛋白質(zhì)的編碼基因表達(dá)的核酸分子；

18、e2）含有e1）所述核酸分子的表達(dá)盒；

19、e3）含有e1）所述核酸分子的重組載體、或含有e2）所述表達(dá)盒的重組載體；

20、e4）含有e1）所述核酸分子的重組微生物、或含有e2）所述表達(dá)盒的重組微生物、或含有e3）所述重組載體的重組微生物；

21、e5）含有e1）所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有e2）所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有e3）所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；

22、e6）含有e1）所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物組織、或含有e2）所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物組織；

23、e7）含有e1）所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物器官、或含有e2）所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物器官。

24、上述應(yīng)用中，蛋白質(zhì)ghglk1編碼基因（cds）的核苷酸序列是seq?id?no?.2所示的核苷酸序列。

25、本發(fā)明第三方面提供了一種提高植物愈傷組織生長或分化的方法，所述方法包括提高目的植物中所述蛋白質(zhì)ghglk1的含量和/或活性，得到愈傷組織生長或分化程度高于所述目的植物的植物，所述植物為棉花。

26、上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白質(zhì)ghglk1的含量和/或活性通過提高目的植物中所述蛋白質(zhì)ghglk1的編碼基因的表達(dá)量實(shí)現(xiàn)。

27、上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白質(zhì)ghglk1的編碼基因的表達(dá)量為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使目的植物基因組中所述蛋白質(zhì)ghglk1的編碼基因的表達(dá)量上升。

28、上述方法中，所述利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使目的植物基因組中所述蛋白質(zhì)ghglk1的編碼基因的表達(dá)量上升是通過向目的植物中導(dǎo)入整合了seq?id?no?.2所示的核酸分子的植物表達(dá)載體進(jìn)行。

29、本發(fā)明的有益效果：

30、本發(fā)明基于棉花 ghglk1基因功能研究的空白，構(gòu)建 ghglk1的過表達(dá)載體以及敲除載體，并發(fā)現(xiàn) ghglk1過表達(dá)植株能夠顯著提高愈傷的生長和分化，極大的縮短轉(zhuǎn)基因作物的轉(zhuǎn)化周期，這對于打破對受體材料基因型的依賴，加速植物轉(zhuǎn)化和再生的循環(huán)具有重要意義。