本發(fā)明屬于納豆激酶微丸制備，具體涉及腸溶緩釋納豆激酶微丸顆粒及其一步成型式制法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、納豆激酶，(nattokinase，nk)是由枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis?)產(chǎn)生的一種具有纖溶活性的絲氨酸蛋白酶，易溶于水，固態(tài)呈淡黃色或白色，無二硫鍵，一般為單鏈多肽結(jié)構(gòu)；其在室溫下，酶活性在ph值6.0～12.0的范圍內(nèi)具有很強(qiáng)的纖維蛋白水解能力，酶反應(yīng)的最適ph值一般為8，酸性和強(qiáng)堿性條件下會迅速失活；酶活力不易受反復(fù)凍融影響，溫度達(dá)50℃以上時酶活性會逐漸喪失，超過60℃酶迅速失活，其最適溫度為45℃。納豆激酶具有良好的溶解血栓的功效，與傳統(tǒng)的溶栓藥物鏈激酶、尿激酶相比具有藥理作用直接且多元化、體內(nèi)半衰期長、分子量相對較小可直接通過胃腸系統(tǒng)被人體吸收、安全性高、價格便宜等諸多優(yōu)點，因此具有廣泛的應(yīng)用前景。

2、目前納豆激酶主要采用發(fā)酵大豆的方式進(jìn)行生產(chǎn)，且在整個發(fā)酵過程中，會產(chǎn)生包括納豆激酶在內(nèi)的多種生物活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)存在于發(fā)酵產(chǎn)物中，最終產(chǎn)物經(jīng)過滅菌、分離、干燥、粉碎得到含有納豆激酶的納豆粉，然后以納豆粉為天然載體，在低溫、密封條件下保存，從而有效維護(hù)了納豆激酶的活力。

3、中國專利cn109722427b公開了一種納豆激酶凍干粉的制備方法，其將納豆菌液態(tài)發(fā)酵得到的發(fā)酵液分離、濃縮后加入保護(hù)劑，然后經(jīng)冷凍干燥得到納豆激酶凍干粉，可以長期有效保存，且具有較高的純度和酶活力。但是，由于納豆粉的活性成分為納豆激酶，屬于蛋白酶，因此在生產(chǎn)和使用過程產(chǎn)生的粉塵易導(dǎo)致接觸人員過敏；此外，在納豆激酶在胃酸中極易失活，因此，需要對含有納豆激酶的納豆粉進(jìn)行包覆處理。

4、中國專利cn100500839c公開了納豆激酶純化工藝及微囊制劑工藝，其將納豆激酶精品與附加劑或賦形劑混合制備得到凍干粉，然后與交聯(lián)cmc-na、微晶纖維素混合制軟材，基礎(chǔ)滾圓機(jī)制微囊丸芯，烘干后與包衣液加入流化床包衣機(jī)中，包衣得到小丸裝膠囊。但是，該專利的制備工藝是先制備得到納豆激酶的粉類產(chǎn)品，然后再利用材料進(jìn)行包覆，這種包覆方式步驟繁瑣、效率較低。

5、中國專利cn103238829b公開了一種納豆激酶腸溶膠囊及其制備方法，其先用鷹嘴豆納豆食品制備得到納豆激酶凍干粉，然后利用甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物的乙醇溶液浸泡包衣3-5次，干燥后得到納豆激酶腸溶膠囊。但是，該專利的制備工藝是先制備得到納豆激酶的粉類產(chǎn)品，然后再利用材料進(jìn)行包覆，這種包覆方式步驟繁瑣、效率較低。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題是：現(xiàn)有技術(shù)中的納豆激酶的包覆產(chǎn)品，通常需要先制備得到納豆激酶的粉類產(chǎn)品，然后再利用包覆材料進(jìn)行包覆。但是，這種制備工藝步驟繁瑣、效率較低并且存在納豆激酶的粉類產(chǎn)品，在生產(chǎn)過程中容易致敏的風(fēng)險。

2、針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供腸溶緩釋納豆激酶微丸顆粒及其一步成型式制法和應(yīng)用，一步法制備得到納豆粉的包覆產(chǎn)品，避免產(chǎn)生含有納豆激酶的粉塵，降低對環(huán)境的污染，同時提高生產(chǎn)效率。

3、具體技術(shù)方案，如下所示：

4、技術(shù)方案1：一種腸溶緩釋納豆激酶微丸顆粒，其特征在于，其通過包括如下步驟的方法制備得到：將含有輔料的納豆激酶發(fā)酵液、緩釋劑溶液和腸溶劑溶液進(jìn)行噴霧干燥得到腸溶緩釋納豆激酶微丸顆粒，其中，以重量百分含量計，所述含有輔料的納豆激酶發(fā)酵液的干物質(zhì)含量為30-60wt%，所述緩釋劑溶液中緩釋劑的含量為0.1-30wt%，所述腸溶劑溶液中腸溶劑的含量為0.1-30wt%。

5、技術(shù)方案2：根據(jù)技術(shù)方案1所述的腸溶緩釋納豆激酶微丸顆粒，其特征在于，將含有輔料的納豆激酶發(fā)酵液在霧化壓力為20-40bar、緩釋劑溶液在霧化壓力為120-205bar和腸溶劑溶液在霧化壓力為120-205?bar的條件下進(jìn)行噴霧干燥后，得到腸溶緩釋納豆激酶微丸顆粒。

6、技術(shù)方案3：根據(jù)技術(shù)方案1或2所述的腸溶緩釋納豆激酶微丸顆粒，其特征在于，將含有輔料的納豆激酶發(fā)酵液、緩釋劑溶液和腸溶劑溶液進(jìn)行同時噴霧干燥，

7、優(yōu)選地，該腸溶緩釋納豆激酶微丸顆粒的經(jīng)ph為1-2的鹽酸溶液處理115-120min后，酶活保存率為75-95%，優(yōu)選地，酶活保存率為88-95%，

8、和/或經(jīng)ph為6.5-7的磷酸緩沖液處理115-120min后，酶活釋放率為58-93%，

9、優(yōu)選地，酶活釋放率為85-90%，

10、和/或經(jīng)ph為6.5-7的磷酸緩沖液處理5-10min后，酶活釋放率為21-49%，

11、優(yōu)選地，酶活釋放率為21-30%。

12、技術(shù)方案4：根據(jù)技術(shù)方案1-3中任一項所述的腸溶緩釋納豆激酶微丸顆粒，其特征在于，納豆激酶發(fā)酵液的干物質(zhì)含量為34-60wt%、和/或緩釋劑溶液中緩釋劑的含量為0.1-25wt%、和/或腸溶劑溶液中腸溶劑的含量為0.1-25wt%。

13、技術(shù)方案5：根據(jù)技術(shù)方案1-4中任一項所述的腸溶緩釋納豆激酶微丸顆粒，其特征在于，所述含有輔料的納豆激酶發(fā)酵液通過如下步驟的方法制備得到：將枯草芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后進(jìn)行過濾、濃縮和除菌精濾，得到納豆激酶發(fā)酵液，將納豆激酶發(fā)酵液和輔料混合后得到所述含有輔料的納豆激酶發(fā)酵液，

14、或所述含有輔料的納豆激酶發(fā)酵液通過如下步驟的方法制備得到：將枯草芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后進(jìn)行過濾、稀釋和除菌精濾，得到納豆激酶發(fā)酵液，將納豆激酶發(fā)酵液和輔料混合后得到所述含有輔料的納豆激酶發(fā)酵液。

15、技術(shù)方案6：根據(jù)技術(shù)方案1-5中任一項所述的腸溶緩釋納豆激酶微丸顆粒，所述含有輔料的納豆激酶發(fā)酵液通過在酶活為700-10000fu/g的納豆激酶發(fā)酵液中加入輔料后制備得到。

16、技術(shù)方案7：根據(jù)技術(shù)方案1-6中任一項所述的腸溶緩釋納豆激酶微丸顆粒，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌amcc?11927，保藏編號為cctcc?no:?m2024343。

17、技術(shù)方案8：根據(jù)技術(shù)方案1-7中任一項所述的腸溶緩釋納豆激酶微丸顆粒，其特征在于，以含有輔料的納豆激酶發(fā)酵液的重量百分含量計，包括納豆激酶發(fā)酵液45-75wt%和輔料25-55wt%，

18、優(yōu)選地，納豆激酶發(fā)酵液55-75wt%、和/或輔料25-45wt%，

19、更優(yōu)選地，納豆激酶發(fā)酵液70-75wt%、和/或輔料25-30wt%。

20、技術(shù)方案9：根據(jù)技術(shù)方案1-8中任一項所述的腸溶緩釋納豆激酶微丸顆粒，其特征在于，所述輔料包括選自由麥芽糊精、玉米淀粉、黃豆粉、α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精、鷹嘴豆粉、大豆肽、大豆分離蛋白、乳清分離蛋白、功能紅曲、羧甲基纖維素鈉和黃原膠構(gòu)成的組中的一種或兩種以上輔料。

21、技術(shù)方案10：根據(jù)技術(shù)方案1-9中任一項所述的腸溶緩釋納豆激酶微丸顆粒，其特征在于，所述輔料包括選自由麥芽糊精、玉米淀粉、大豆肽、功能紅曲、a-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、黃原膠、鷹嘴豆粉、大豆分離蛋白粉、乳清分離蛋白粉和羧甲基纖維素鈉構(gòu)成的組中的一種或兩種以上輔料，

22、優(yōu)選地，所述輔料包括麥芽糊精，

23、優(yōu)選地，所述輔料包括玉米淀粉、大豆肽和功能紅曲，其中，所述功能紅曲為含有4-6wt％洛伐他汀的紅曲米粉，更優(yōu)選地，以所述輔料的重量百分含量計，包括15-20wt%玉米淀粉、10-15wt%大豆肽和10-15wt%功能紅曲，

24、優(yōu)選地，所述輔料包括功能紅曲、a-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和黃原膠，更優(yōu)選地，以所述輔料的重量百分含量計，包括15-20wt%功能紅曲、5-10wt%a-環(huán)糊精、5-10wt%β-環(huán)糊精和0.1-0.2wt%黃原膠，

25、優(yōu)選地，所述輔料包括鷹嘴豆粉、大豆分離蛋白粉、乳清分離蛋白粉和羧甲基纖維素鈉，更優(yōu)選地，以所述輔料的重量百分含量計，包括35-40wt%鷹嘴豆粉、3-7wt%大豆分離蛋白粉、3-7wt%乳清分離蛋白粉和0.1-0.15wt%羧甲基纖維素鈉。

26、技術(shù)方案11：根據(jù)技術(shù)方案1-10中任一項所述的腸溶緩釋納豆激酶微丸顆粒，其特征在于，所述的緩釋劑包括選自由羥丙基甲基纖維素，海藻酸鈉，甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物，聚醋酸乙烯酯，殼聚糖和聚乙烯醇構(gòu)成的組中的一種或兩種以上緩釋劑，

27、優(yōu)選地，所述的緩釋劑包括羥丙基甲基纖維素，更優(yōu)選地，以緩釋劑溶液的重量百分含量計，包括羥丙基甲基纖維素1-5wt%。

28、技術(shù)方案12：根據(jù)技術(shù)方案1-11中任一項所述的腸溶緩釋納豆激酶微丸顆粒，其特征在于，所述的緩釋劑包括海藻酸鈉，甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物，聚醋酸乙烯酯，殼聚糖和聚乙烯醇構(gòu)成的組中的一種或兩種以上物質(zhì)，

29、優(yōu)選地，所述的緩釋劑包括海藻酸鈉和甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物，更優(yōu)選地，以緩釋劑溶液的重量百分含量計，包括海藻酸鈉0.05-1wt%，甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物0.05-1wt%，

30、優(yōu)選地，所述的緩釋劑包括海藻酸鈉和聚醋酸乙烯酯，更優(yōu)選地，以緩釋劑溶液的重量百分含量計，包括海藻酸鈉10-20wt%和聚醋酸乙烯酯5-15wt%。

31、優(yōu)選地，所述的緩釋劑包括海藻酸鈉、殼聚糖和聚乙烯醇，更優(yōu)選地，以緩釋劑的重量百分含量計，包括海藻酸鈉1-5wt%、殼聚糖1-5wt%和聚乙烯醇1-5wt%。

32、技術(shù)方案13：根據(jù)技術(shù)方案1-12中任一項所述的腸溶緩釋納豆激酶微丸顆粒，其特征在于，所述的腸溶劑包括選自由甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物，羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯，羥丙甲纖維素琥珀酸酯，果膠和蟲膠構(gòu)成的組中的一種或兩種以上腸溶劑，

33、優(yōu)選地，所述的腸溶劑包括甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物，更優(yōu)選地，以腸溶劑溶液的重量百分含量計，包括甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物5-15wt%，

34、優(yōu)選地，所述的腸溶劑包括羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸，更優(yōu)選地，以腸溶劑的重量百分含量計，包括羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸0.1-0.5wt%，

35、優(yōu)選地，所述的腸溶劑包括羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯和羥丙甲纖維素琥珀酸酯，更優(yōu)選地，以腸溶劑溶液的重量百分含量計，包括10-15wt%羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯和10-15wt%羥丙甲纖維素琥珀酸酯。

36、優(yōu)選地，所述的腸溶劑包括羥丙甲纖維素琥珀酸酯，果膠和蟲膠，更優(yōu)選地，以腸溶劑溶液的重量百分含量計，包括1-5wt%羥丙甲纖維素琥珀酸酯，1-5wt%果膠和1-5wt%蟲膠。

37、技術(shù)方案14：根據(jù)技術(shù)方案1-13中任一項所述的腸溶緩釋納豆激酶微丸顆粒，其特征在于，所述緩釋劑溶液通過水制備得到，腸溶劑溶液通過水制備得到。

38、技術(shù)方案15：一種技術(shù)方案1-14中任一項所述的腸溶緩釋納豆激酶微丸顆粒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：將含有輔料的納豆激酶發(fā)酵液、緩釋劑溶液和腸溶劑溶液進(jìn)行噴霧干燥得到腸溶緩釋納豆激酶微丸顆粒，其中，以重量百分含量計，所述含有輔料的納豆激酶發(fā)酵液的干物質(zhì)含量為30-60wt%，所述緩釋劑溶液中緩釋劑的含量為0.1-30wt%，所述腸溶劑溶液中腸溶劑的含量為0.1-30wt%。

39、技術(shù)方案16：根據(jù)技術(shù)方案15所述的制備方法，其特征在于，噴霧干燥時，含有輔料的納豆激酶發(fā)酵液的噴孔直徑為2-3.5mm、和/或霧化壓力為20-38bar，優(yōu)選地，含有輔料的納豆激酶發(fā)酵液的噴孔直徑為2.4-3mm、和/或霧化壓力為20-30bar。

40、技術(shù)方案17：根據(jù)技術(shù)方案15或16所述的制備方法，其特征在于，噴霧干燥時，緩釋劑溶液的噴孔直徑為0.8-2.0mm，霧化壓力為120-200?bar，優(yōu)選地，緩釋劑溶液的噴孔直徑為0.8-1.2mm，霧化壓力為120-130bar。

41、技術(shù)方案18：根據(jù)技術(shù)方案15-17中任一項所述的制備方法，其特征在于，噴霧干燥時，腸溶劑溶液的噴孔直徑為0.8-2.0mm，霧化壓力為120-200?bar，優(yōu)選地，腸溶劑溶液的噴孔直徑為0.8-1.2mm，霧化壓力為120-130bar。

42、技術(shù)方案19：根據(jù)技術(shù)方案15-18中任一項所述的制備方法，其特征在于，噴霧干燥時，含有輔料的納豆激酶發(fā)酵液的進(jìn)料流量為0.3-0.9m3/h、和/或緩釋劑溶液的進(jìn)料流量為0.18-0.6m3/h、和/或腸溶劑的進(jìn)料流量為0.12-0.6m3/h。

43、技術(shù)方案20：根據(jù)技術(shù)方案15-19中任一項所述的制備方法，其特征在于，噴霧干燥時，進(jìn)風(fēng)溫度為120-171℃、和/或出風(fēng)溫度為64-87℃、和/或塔內(nèi)負(fù)壓為-300至0?pa。

44、技術(shù)方案21：一種腸溶緩釋納豆激酶微丸顆粒，其特征在于，通過技術(shù)方案15-20中任一項所述的制備方法制備得到。

45、技術(shù)方案22：技術(shù)方案1-13中任一項所述的、或技術(shù)方案21所述的腸溶緩釋納豆激酶微丸顆粒在食品中的應(yīng)用。

46、技術(shù)方案23：技術(shù)方案1-13中任一項所述的、或技術(shù)方案21所述的腸溶緩釋納豆激酶微丸顆粒在制備保健品中的應(yīng)用。

47、本發(fā)明的有益效果在于：將含有輔料的納豆激酶發(fā)酵液、緩釋劑溶液和腸溶劑溶液，同時進(jìn)行噴霧干燥。噴霧干燥時，通過在噴霧干燥塔和旋風(fēng)分離器中循環(huán)，對納豆激酶發(fā)酵液實現(xiàn)一步干燥、成型和包覆，從而得到腸溶緩釋納豆激酶微丸顆粒，提高了制備效率，避免產(chǎn)生的含有納豆激酶的粉塵分散在生產(chǎn)環(huán)境中，污染環(huán)境的同時提高致敏風(fēng)險。

48、菌株材料信息

49、本發(fā)明所用的枯草芽孢桿菌（ bacillus?subtilis）amcc?11927,于2024年02月27日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為:中國，武漢，武漢大學(xué)，保藏編號為cctcc?no:m?2024343，保藏地址：中國，武漢，武漢大學(xué)，郵政編碼：430072；電話：027-68754052。該菌株已記載于公開號為cn118256404b的中國專利申請中。