背景技術(shù)：

1、在血管損傷部位的血小板活化和隨后的血栓形成對(duì)于正常的止血至關(guān)重要，但也會(huì)導(dǎo)致心肌梗死和中風(fēng)。血小板粘附和活化是涉及多種血小板受體-配體相互作用的多步驟過(guò)程。在血管壁受損后，循環(huán)中的血小板通過(guò)糖蛋白(gp)ib-v-ix復(fù)合物與固定在暴露的內(nèi)皮下細(xì)胞外基質(zhì)上(例如在膠原上)的von?willebrand因子(vwf)的瞬時(shí)相互作用而迅速減速。

2、通常，止血是這樣的生理機(jī)制，其通過(guò)循環(huán)血小板和血漿凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的交織活化來(lái)限制血管損傷后的出血1。血小板與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和von?willebrand因子(vwf)的粘附啟動(dòng)了由暴露的內(nèi)皮下組織因子(tf)支持的止血反應(yīng)，其觸發(fā)凝血和局部凝血酶生成2。這導(dǎo)致纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)將血小板包裹在穩(wěn)定的血栓中3。凝血酶的生成需要前饋反應(yīng)，前饋反應(yīng)涉及通過(guò)凝血酶介導(dǎo)的g蛋白偶聯(lián)蛋白酶活化受體(par)的切割和活化而引起的血小板活化4以及在活化的血小板的表面上的凝血反應(yīng)的放大5。生成的凝血酶形成纖維蛋白并且從而通過(guò)血小板受體gpiib/iiia接合來(lái)穩(wěn)定血栓，并且活化fxiii以交聯(lián)纖維蛋白纖維6。這些過(guò)程被高保真地調(diào)節(jié)7，以確保有效的止血，同時(shí)防止血栓形成和血栓性炎性疾病8,9。此外，循環(huán)中的凝血酶活性受到特定的血漿凝血抑制劑和內(nèi)皮細(xì)胞上的血栓調(diào)節(jié)蛋白的限制，所述血栓調(diào)節(jié)蛋白捕獲凝血酶以啟動(dòng)凝血調(diào)節(jié)和血管保護(hù)性蛋白c途徑10。

3、糖蛋白(gp)ib-ix復(fù)合物介導(dǎo)血小板與vwf的結(jié)合，并且對(duì)于止血至關(guān)重要。在gp1ba、gp1bb或gp9中的突變引起巨血小板綜合征(bernard-soulier?syndrome，bss)，其為以巨大血小板為特征的罕見(jiàn)出血病癥11,12。gpv與gpib-ix復(fù)合物締合，但不是gpib表達(dá)或功能性相互作用所必需的13。gpv是高豐度的88kda的血小板/巨核細(xì)胞特異性的富含亮氨酸的重復(fù)(lrr)跨膜蛋白14，其與膠原相互作用15并且對(duì)于血小板功能具有次要的重要性16,17。gpv在血栓形成期間被凝血酶蛋白水解切割18,19，但是脫落的69kda細(xì)胞外片段在止血和血栓形成中的生理作用仍然不清楚。

4、在保持止血的同時(shí)預(yù)防血栓形成一直是抗血栓藥物開(kāi)發(fā)的核心目標(biāo)。盡管靶選擇性口服抗凝劑的應(yīng)用更廣泛且安全性更高，但預(yù)防出血并發(fā)癥仍然是未滿足的臨床需求。盡管最近的研究提供了證明血小板介導(dǎo)的凝血酶生成能夠挽救由于增加的纖溶而引起的出血缺陷的原理驗(yàn)證47，但是仍存在對(duì)纖維蛋白形成的更普遍和更具體的時(shí)空控制的未滿足的臨床需求。批準(zhǔn)了新的止血?jiǎng)┗蛘陂_(kāi)發(fā)新的止血?jiǎng)┮岳@過(guò)凝血級(jí)聯(lián)中的遺傳或獲得性缺陷48，但是血小板輸注仍然是急性恢復(fù)有缺陷的血小板功能或嚴(yán)重形式的血小板減少癥以確保止血的唯一治療選擇。

5、wo?2017/109180?a1描述了用于用作凝血?jiǎng)┑膅pv抑制劑。實(shí)施例提及一種單克隆大鼠抗小鼠gpv抗體。然而，所研究的抗體被描述為對(duì)凝血酶介導(dǎo)的gpv的切割沒(méi)有影響。

6、本技術(shù)的發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，抑制凝血酶介導(dǎo)的gpv的切割的抗體具有優(yōu)異的促凝活性，并且能夠用于促進(jìn)止血。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明特別涉及權(quán)利要求書(shū)中定義的主題。例如，它提供了新的抗體、其片段或衍生物以及相應(yīng)的醫(yī)療用途。

2、本發(fā)明具體涉及以下項(xiàng)目[1]至[54]：

3、[1]一種能夠與人血小板糖蛋白v(gpv)結(jié)合的抗體或其功能性片段或衍生物，其中所述抗體、功能性片段或衍生物抑制凝血酶介導(dǎo)的gpv的切割。

4、[2]根據(jù)[1]的抗體、片段或衍生物，其中所述抗體、片段或衍生物能夠與gpv的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合。

5、[3]根據(jù)[2]的抗體、片段或衍生物，其中所述抗體、片段或衍生物能夠與gpv的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的區(qū)域結(jié)合，該區(qū)域不同于gpv的膠原結(jié)合位點(diǎn)。

6、[4]根據(jù)[1]至[3]中任一項(xiàng)的抗體或其功能性片段或功能性衍生物，其中所述抗體、片段或衍生物不延遲膠原誘導(dǎo)的聚集。

7、[5]根據(jù)[1]至[4]中任一項(xiàng)的抗體或其片段或衍生物，其中所述抗體、片段或衍生物加速纖維蛋白形成，增加纖維蛋白形成和/或改善形成的纖維蛋白結(jié)構(gòu)，特別是加速并增加纖維蛋白形成，尤其是局部纖維蛋白形成而不是全身纖維蛋白形成。

8、[6]根據(jù)[1]至[5]中任一項(xiàng)的抗體或其片段或衍生物，其中所述抗體、片段或衍生物在施用于受試者后不影響受試者的血小板數(shù)量。

9、[7]抗體或其片段或衍生物，優(yōu)選根據(jù)[1]至[6]中任一項(xiàng)的抗體或其片段或衍生物，其包含(i)包含cdr1、cdr2和cdr3的vh結(jié)構(gòu)域，所述cdr1具有如seq?id?no:15所示的氨基酸序列，所述cdr2具有如seq?id?no:16所示的氨基酸序列，并且所述cdr3具有如seq?idno:17所示的氨基酸序列，以及(ii)包含cdr1、cdr2和cdr3的vl結(jié)構(gòu)域，所述cdr1具有與如seq?id?no:18所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列，所述cdr2具有與如seq?id?no:19所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列，并且所述cdr3具有與如seq?id?no:20所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列；或者

10、其中所述抗體與抗體競(jìng)爭(zhēng)與gpv結(jié)合，該抗體包含：(i)包含cdr1、cdr2和cdr3的vh結(jié)構(gòu)域，所述cdr1具有如seq?id?no:15所示的氨基酸序列，所述cdr2具有如seq?id?no:16所示的氨基酸序列，并且所述cdr3具有如seq?id?no:17所示的氨基酸序列，以及(ii)包含cdr1、cdr2和cdr3的vl結(jié)構(gòu)域，所述cdr1具有與如seq?id?no:18所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列，所述cdr2具有與如seq?id?no:19所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列，并且所述cdr3具有與如seq?id?no:20所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列。

11、[8]根據(jù)[1]至[7]中任一項(xiàng)的抗體、片段或衍生物，其中所述vh結(jié)構(gòu)域包含如seqid?no:21所示的氨基酸序列，并且所述vl結(jié)構(gòu)域包含如seq?id?no:23所示的氨基酸序列；或者其中所述抗體、片段或衍生物與具有包含如seq?id?no:21所示的氨基酸序列的vh結(jié)構(gòu)域和包含如seq?id?no:23所示的氨基酸序列的vl結(jié)構(gòu)域的抗體特異性競(jìng)爭(zhēng)與gpv表位的結(jié)合。

12、[9]抗體或其片段或衍生物，優(yōu)選為根據(jù)[1]至[6]中任一項(xiàng)的抗體或其片段或衍生物，其包含：(i)包含cdr1、cdr2和cdr3的vh結(jié)構(gòu)域，所述cdr1具有如seq?id?no:1所示的氨基酸序列，所述cdr2具有如seq?id?no:2所示的氨基酸序列，并且所述cdr3具有如seq?idno:3所示的氨基酸序列，以及(ii)包含cdr1、cdr2和cdr3的vl結(jié)構(gòu)域，所述cdr1具有與如seq?id?no:4所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列，所述cdr2具有與如seq?id?no:5所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列，并且所述cdr3具有與如seq?id?no:6所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列，或者

13、其中所述抗體與抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合gpv，該抗體包含：(i)包含cdr1、cdr2和cdr3的vh結(jié)構(gòu)域，所述cdr1具有如seq?id?no:1所示的氨基酸序列，所述cdr2具有如seq?id?no:2所示的氨基酸序列，并且所述cdr3具有如seq?id?no:3所示的氨基酸序列，以及(ii)包含cdr1、cdr2和cdr3的vl結(jié)構(gòu)域，所述cdr1具有與如seq?id?no:4所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列，所述cdr2具有與如seq?id?no:5所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列，并且所述cdr3具有與如seq?id?no:6所示的氨基酸序列一致的氨基酸序列。

14、[10]根據(jù)[1]至[6]或[9]的抗體、片段或衍生物，其中所述vh結(jié)構(gòu)域包含如seq?idno:7所示的氨基酸序列，并且所述vl結(jié)構(gòu)域包含如seq?id?no:9所示的氨基酸序列，或者其中所述抗體、片段或衍生物與具有包含如seq?id?no:7所示的氨基酸序列的vh結(jié)構(gòu)域和包含如seq?id?no:9所示的氨基酸序列的vl結(jié)構(gòu)域的抗體特異性競(jìng)爭(zhēng)與gpv表位的結(jié)合。

15、[11]根據(jù)[1]至[10]中任一項(xiàng)的抗體、片段或衍生物，其中所述抗體是單克隆抗體。

16、[12]一種核酸，其編碼根據(jù)[1]至[11]中任一項(xiàng)的抗體、片段或衍生物。

17、[13]一種宿主細(xì)胞，其包含[12]的核酸。

18、[14]一種制備根據(jù)[1]至[11]中任一項(xiàng)的抗體、片段或衍生物的方法，其包括在允許表達(dá)所述抗體、片段或衍生物的合適條件下培養(yǎng)[13]的宿主細(xì)胞，并回收所述抗體、片段或衍生物。

19、[15]一種藥物組合物，其包含根據(jù)[1]至[11]中任一項(xiàng)的抗體、片段或衍生物或根據(jù)[12]的核酸。

20、[16]根據(jù)[15]的藥物組合物，其中所述組合物還包括藥學(xué)上可接受的賦形劑。

21、[17]根據(jù)[1]至[11]中任一項(xiàng)的抗體、片段或衍生物，其用于醫(yī)學(xué)中，特別是用于改善止血，優(yōu)選恢復(fù)止血。

22、[18]根據(jù)[1]至[11]中任一項(xiàng)的抗體、片段或衍生物，其用于治療或預(yù)防出血狀況和/或用于逆轉(zhuǎn)抗血小板和/或抗凝藥物的效果，例如用于逆轉(zhuǎn)緊急出血控制中的效果。

23、[19]根據(jù)[17]或[18]的用于使用的抗體、片段或衍生物，其中i)所述醫(yī)學(xué)中的用途或出血狀況是由血小板病癥引起/導(dǎo)致的，尤其是其中所述血小板病癥以減少的血小板數(shù)量為特征和/或ii)所述醫(yī)學(xué)中的用途是由選自以下的狀況引起的或所述出血狀況選自炎性出血、血友病/fviii、由于抗血小板治療引起的出血、由于抗凝劑治療引起的出血、出血性中風(fēng)、由于敗血癥引起的過(guò)度出血、由于血小板減少癥引起的過(guò)度出血、由于彌散性血管內(nèi)凝血(dic)引起的過(guò)度出血、由于化療引起的過(guò)度出血、由于溶血性尿毒綜合征引起的過(guò)度出血、施用可溶性gpv后的過(guò)度出血和由于hiv感染引起的過(guò)度出血。

24、[20]根據(jù)[17]或[18]的用于使用的抗體、片段或衍生物，其中所述醫(yī)學(xué)中的用途或出血狀況是由血小板病癥引起/導(dǎo)致的，尤其是其中所述血小板病癥以減少的血小板數(shù)量為特征，和/或其中所述醫(yī)學(xué)或出血狀況中的用途是抗出血治療，特別是用于增加和/或使具有延長(zhǎng)的出血時(shí)間的患者的出血時(shí)間正?；?，優(yōu)選地，延長(zhǎng)的出血時(shí)間是由血小板減少癥、遺傳缺陷和/或抗血小板療法(例如氯吡格雷)引起的。

25、[21]根據(jù)[17]或[18]的用于使用的抗體、片段或衍生物，其中所述醫(yī)學(xué)中的用途是由選自以下的狀況引起的或所述出血狀況選自炎性出血、血友病/fviii、由于抗血小板治療引起的出血、由于抗凝劑治療引起的出血、出血性中風(fēng)、由于敗血癥引起的過(guò)度出血、由于血小板減少癥引起的過(guò)度出血、由于彌散性血管內(nèi)凝血(dic)引起的過(guò)度出血、由于化療引起的過(guò)度出血、由于溶血性尿毒綜合征引起的過(guò)度出血、施用可溶性gpv后的過(guò)度出血和由于hiv感染引起的過(guò)度出血。

26、[22]根據(jù)[17]至[21]中任一項(xiàng)的用于使用的抗體、片段或衍生物，其中所述抗體、片段或衍生物i)減少凝血酶對(duì)gpv的切割，和/或ii)加速纖維蛋白形成，和/或iii)在施用于受試者后不影響受試者的血小板數(shù)量，iv)用作凝血?jiǎng)?/p>

27、[23]根據(jù)[17]至[22]中任一項(xiàng)的用于使用的抗體、片段或衍生物，其中所述抗體、片段或衍生物減少凝血酶對(duì)gpv的切割。

28、[24]根據(jù)[17]至[23]中任一項(xiàng)的用于使用的抗體、片段或衍生物，其中所述抗體、片段或衍生物加速纖維蛋白形成和/或改善纖維蛋白結(jié)構(gòu)。

29、[25]根據(jù)[17]至[24]中任一項(xiàng)的用于使用的抗體、片段或衍生物，其中所述抗體、片段或衍生物在施用于受試者后不影響受試者的血小板數(shù)量。

30、[26]根據(jù)[17]至[25]中任一項(xiàng)的用于使用的抗體、片段或衍生物，其中所述抗體、片段或衍生物用作凝血?jiǎng)?/p>

31、[27]根據(jù)[12]的核酸，其用于醫(yī)學(xué)中，特別是用于改善止血。

32、[28]根據(jù)[12]的核酸，其用于治療或預(yù)防出血狀況。

33、[29]根據(jù)[28]的用于使用的核酸，其中i)所述出血狀況由血小板病癥引起，尤其是其中所述血小板病癥以減少的血小板數(shù)量為特征和/或ii)所述出血狀況選自炎性出血、血友病/fviii、由于抗血小板治療引起的出血、由于抗凝血治療引起的出血、出血性中風(fēng)、由于敗血癥引起的過(guò)度出血、由于血小板減少癥引起的過(guò)度出血、由于彌散性血管內(nèi)凝血(dic)引起的過(guò)度出血、由于化療引起的過(guò)度出血、由于溶血性尿毒綜合征引起的過(guò)度出血、施用可溶性gpv后的過(guò)度出血和由于hiv感染引起的過(guò)度出血。

34、[30]根據(jù)[28]或[29]的用于使用的核酸，其中所述出血狀況由血小板病癥引起，尤其是其中所述血小板病癥以減少的血小板數(shù)量為特征。

35、[31]根據(jù)[28]、[29]或[30]的用于使用的核酸，其中所述出血狀況選自炎性出血、血友病/fviii、由于抗血小板治療引起的出血、由于抗凝劑治療引起的出血、出血性中風(fēng)、由于敗血癥引起的過(guò)度出血、由于血小板減少癥引起的過(guò)度出血、由于彌散性血管內(nèi)凝血(dic)引起的過(guò)度出血、由于化療引起的過(guò)度出血、由于溶血性尿毒綜合征引起的過(guò)度出血、施用可溶性gpv后的過(guò)度出血和由于hiv感染引起的過(guò)度出血。

36、[32]根據(jù)[27]至[31]中任一項(xiàng)的用于使用的核酸，其中所述核酸i)減少凝血酶對(duì)gpv的切割，和/或ii)加速纖維蛋白形成，和/或iii)在施用于受試者后不影響受試者的血小板數(shù)量，iv)用作凝血?jiǎng)?/p>

37、[33]根據(jù)[27]至[31]中任一項(xiàng)的用于使用的核酸，其中所述核酸減少凝血酶對(duì)gpv的切割。

38、[34]根據(jù)[27]至[31]中任一項(xiàng)的用于使用的核酸，其中所述核酸加速纖維蛋白形成。

39、[35]根據(jù)[27]至[31]中任一項(xiàng)的用于使用的核酸，其中所述核酸在施用于受試者后不影響受試者的血小板數(shù)量。

40、[36]根據(jù)[27]至[31]中任一項(xiàng)的用于使用的核酸，其中所述核酸用作凝血?jiǎng)?/p>

41、[37]根據(jù)[15]或[16]的藥物組合物，其用于醫(yī)學(xué)中，特別是用于改善止血。

42、[38]根據(jù)[15]或[16]的藥物組合物，其用于治療或預(yù)防出血狀況。

43、[39]根據(jù)[37]或[38]的用于使用的藥物組合物，其中所述出血狀況選自炎性出血、血友病/fviii、由于抗血小板治療引起的出血、由于抗凝血治療引起的出血、出血性中風(fēng)、由于敗血癥引起的過(guò)度出血、由于血小板減少癥引起的過(guò)度出血、由于彌散性血管內(nèi)凝血(dic)引起的過(guò)度出血、由于化療引起的過(guò)度出血、由于溶血性尿毒綜合征引起的過(guò)度出血、施用可溶性gpv后的過(guò)度出血和由于hiv感染引起的過(guò)度出血。

44、[40]根據(jù)[37]或[38]的用于使用的藥物組合物，其中所述出血狀況由血小板病癥引起，尤其是其中所述血小板病癥以減少的血小板數(shù)量為特征。

45、[41]根據(jù)[37]或[38]的用于使用的藥物組合物，其中所述出血狀況選自炎性出血、血友病/fviii、由于抗血小板治療引起的出血、由于抗凝劑治療引起的出血、出血性中風(fēng)、由于敗血癥引起的過(guò)度出血、由于血小板減少癥引起的過(guò)度出血、由于彌散性血管內(nèi)凝血(dic)引起的過(guò)度出血、由于化療引起的過(guò)度出血、由于溶血性尿毒綜合征引起的過(guò)度出血、施用可溶性gpv后的過(guò)度出血和由于hiv感染引起的過(guò)度出血。

46、[42]根據(jù)[37]至[41]中任一項(xiàng)的用于使用的藥物組合物，其中所述藥物組合物i)減少凝血酶對(duì)gpv的切割，和/或ii)加速纖維蛋白形成，和/或iii)在施用于受試者后不影響受試者的血小板數(shù)量，iv)用作凝血?jiǎng)?/p>

47、[43]根據(jù)[37]至[41]中任一項(xiàng)的用于使用的藥物組合物，其中所述藥物組合物減少凝血酶對(duì)gpv的切割。

48、[44]根據(jù)[37]至[41]中任一項(xiàng)的用于使用的藥物組合物，其中所述藥物組合物加速纖維蛋白形成。

49、[45]根據(jù)[37]至[41]中任一項(xiàng)的用于使用的藥物組合物，其中所述藥物組合物在施用于受試者后不影響受試者的血小板數(shù)量。

50、[46]根據(jù)[37]至[41]中任一項(xiàng)的用于使用的藥物組合物，其中所述藥物組合物用作凝血?jiǎng)?/p>

51、[47]根據(jù)[17]至[46]中任一項(xiàng)的用于使用的抗體、片段、衍生物、核酸或藥物組合物，其中所述治療或預(yù)防包括向受試者，優(yōu)選向人受試者，施用藥學(xué)有效量的所述抗體、片段、衍生物、核酸或藥物組合物。

52、[48]根據(jù)[17]至[47]中任一項(xiàng)的用于使用的抗體、片段、衍生物、核酸或藥物組合物，其中所述治療或預(yù)防還包括向所述受試者施用除所述抑制劑以外的凝血?jiǎng)?/p>

53、[49]根據(jù)[48]的用于使用的抗體、片段、衍生物、核酸或藥物組合物，其中所述除所述抑制劑以外的凝血?jiǎng)┻x自抗纖溶劑、血小板濃縮物、凝血因子濃縮物和新鮮冷凍血漿。

54、[50]一種宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)[1]至[11]中任一項(xiàng)的抗體或其片段或衍生物或根據(jù)[12]的核酸。

55、[51]一種用于生產(chǎn)根據(jù)[1]至[11]中任一項(xiàng)的抗體或其片段或衍生物的方法，其包括使用根據(jù)[50]的宿主細(xì)胞。

56、[52]一種治療受試者、優(yōu)選人的出血狀況的方法，其包括向所述受試者施用有效量的根據(jù)[1]至[11]中任一項(xiàng)的抗體或其片段或衍生物、根據(jù)[12]的核酸或根據(jù)[15]或[16]的藥物組合物。

57、[53]根據(jù)[52]的方法，進(jìn)一步特征在于如[17]至[49]中任一項(xiàng)所述的表征。

58、[54]一種抗體或其片段或衍生物，其與[8]中定義的抗體結(jié)合相同表位，任選地其中所述抗體、片段或衍生物是與[1]至[11]中任一項(xiàng)一致的抗體、片段或衍生物。

59、本公開(kāi)(如上所述)的抗血小板治療可以涉及但不限于阿司匹林、adp受體抑制劑(例如氯吡格雷、普拉格雷或替卡格雷)、抗gpvi治療(例如glencozimab)、脾酪氨酸激酶抑制劑(例如福他替尼)、bruton酪氨酸激酶抑制劑、gpibα抑制劑(例如volociximab)、雙嘧達(dá)莫或蛋白酶活化受體-1抑制劑(例如沃拉帕沙)。如本公開(kāi)所述(如上所述)可以治療的抗凝病況可以由先前攝入華法林、肝素、低分子量肝素(lmwh，例如依諾肝素、達(dá)肝素或亭扎肝素)、抗凝血酶iii活化劑(例如磺達(dá)肝癸鈉)、凝血酶抑制劑(例如達(dá)比加群)或因子xa抑制劑(例如利伐沙班、艾多沙班或阿哌沙班)引起。