本披露部分地涉及細胞農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。在特別實施例中，本披露涉及循環(huán)產(chǎn)生脂肪細胞的方法。更特別地，本披露的實施例涉及將脂肪細胞循環(huán)去分化為dfat細胞并且隨后將dfat細胞再分化。本文披露的系統(tǒng)和方法可以特別用于產(chǎn)生可口的仿制肉類產(chǎn)品。本披露還涉及其他商業(yè)上有價值的領(lǐng)域，包括但不限于芳香劑和風味劑、細胞療法、化妝品、藥物發(fā)現(xiàn)、工業(yè)制造、再生醫(yī)學、可再生能源和獸醫(yī)學。

背景技術(shù)：

1、超過50％的24-39歲的美國人現(xiàn)在將自己描述為彈性素食者，使得越來越多的消費者正在尋求肉類替代品，以支持更可持續(xù)的、環(huán)境友好的且道德的飲食。然而，大多數(shù)消費者(彈性素食者或其他消費者)一直不愿意完全接受肉類替代品，諸如植物性肉類替代品(pbma)，因為例如傳統(tǒng)肉類產(chǎn)品與其替代品之間的差異仍然明顯，并且高度加工的肉類替代品中冗長的成分列表也會讓消費者望而卻步。

2、感知的味道/質(zhì)地、成本、健康和可持續(xù)性是pbma客戶飲食決策的關(guān)鍵驅(qū)動因素。重要的是，雖然大多數(shù)pbma面向素食消費者，但素食主義者只占這樣的銷售額的2％，其余98％是想要消費較少的肉類產(chǎn)品、但可能不愿意完全過渡到素食飲食的人。因此，pbma仍然只占肉類銷售額的1.5％。

3、培養(yǎng)肉，也稱為體外或?qū)嶒炇疑L的肉類，是一種有前途的技術(shù)，因為它可以減少肉類生產(chǎn)所需的溫室氣體排放、土地利用和水利用。這項技術(shù)仍處于起步階段，并且雖然許多公司已經(jīng)展示了試點產(chǎn)品，但成本和擴大規(guī)模的挑戰(zhàn)仍是商業(yè)化的障礙。另外，當今新興的培養(yǎng)肉產(chǎn)品在生產(chǎn)期間依賴于胎牛血清(fbs)作為生長培養(yǎng)基。由于必須直接從被宰牛的胎兒中收獲fbs，因此需要大量的質(zhì)量控制程序和監(jiān)管監(jiān)督來防止污染并確保符合道德標準，所以成本高昂。

4、常規(guī)肉類產(chǎn)品及其替代品之間的關(guān)鍵風味差異是由脂肪含量導致的。例如，植物性肉類公司已經(jīng)嘗試使用復雜的成分混合物來模擬脂肪；然而，這種方法不能真正地模仿希望的質(zhì)地/味道，并且還導致配料表冗長。實際上，風味添加劑占pbma產(chǎn)品的約3％-10％，并且嘗試模仿脂肪組織經(jīng)常被認為是pbma配方設(shè)計師所面臨的最大挑戰(zhàn)。

5、因此，需要通過向動物脂肪組織添加改進的替代品來增強pbma和其他肉類替代品的各種特性的新方法。本披露通過提供來自各種動物物種的脂肪產(chǎn)生細胞(fat-producingcell)來滿足這種需求，所述脂肪產(chǎn)生細胞可以摻入替代性肉類產(chǎn)品中以產(chǎn)生具有更短成分列表和與傳統(tǒng)肉類產(chǎn)品一致的味道/質(zhì)地特征的令人信服的高質(zhì)量肉類替代品。本披露滿足了這種需求并且還提供了其他優(yōu)點。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、在一方面，本披露提供了一種循環(huán)產(chǎn)生脂肪細胞的方法，所述方法包括將成熟脂肪細胞群體去分化以產(chǎn)生第一去分化脂肪細胞(dfat細胞)群體。在一些實施例中，所述方法包括在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)第一dfat細胞群體，直至達到第一靶生物質(zhì)。在某些實施例中，然后將第一靶生物質(zhì)傳代培養(yǎng)為一個或多個傳代培養(yǎng)dfat細胞群體。所述一個或多個傳代培養(yǎng)群體可以再分化，例如以形成再分化的成熟脂肪細胞。在一些實施例中，所述方法包括將第一靶生物質(zhì)內(nèi)的一個或多個daft細胞再分化為再分化的成熟脂肪細胞。

2、可以將再分化的成熟脂肪細胞分成第一部分和第二部分。在這樣的實施例中，所述方法進一步包括將再分化的成熟脂肪細胞的第一部分去分化以產(chǎn)生第二代dfat細胞，并且在培養(yǎng)基中培養(yǎng)再分化的成熟脂肪細胞的第二部分以積累靶脂質(zhì)質(zhì)量。在特別實施例中，所述靶脂質(zhì)積累為細胞體積的約90％。在特別實施例中，所述靶脂質(zhì)積累將低至細胞體積的20％。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，靶脂質(zhì)積累取決于進料試劑的積累時間和濃度，其中細胞的脂質(zhì)積累能力為細胞體積的約15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、95％、或更多，其中具體值由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。在特別實施例中，所述培養(yǎng)基包含濃度為從約4％葡萄糖(即，4g/l葡萄糖)至約20％葡萄糖(即，20g/l葡萄糖)、或從約4％至約15％葡萄糖、或從約4％至約10％葡萄糖、或從約4％至約8％葡萄糖、或約4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、或19％葡萄糖(g/l)的葡萄糖。在一些實施例中，所述培養(yǎng)基包含4.5％葡萄糖(g/l)。

3、在某些實施例中，使用再分化培養(yǎng)基。再分化培養(yǎng)基可以包含例如胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-x補充劑、吲哚美辛、地塞米松、羅格列酮、生物素、泛酸鹽、pparγ激動劑、油酸鈉、麥胚凝集素、或其任何組合。

4、在一些實施例中，所述方法進一步包括：i)將所述再分化的成熟脂肪細胞的至少一部分去分化以產(chǎn)生第二代dfat細胞；ii)在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述第二代dfat細胞，直至獲得第二靶生物質(zhì)；iii)將所述第二靶生物質(zhì)傳代培養(yǎng)為第二代傳代培養(yǎng)的dfat細胞；以及iv)將所述第二代傳代培養(yǎng)的dfat細胞再分化為第二代再分化的成熟脂肪細胞。

5、所述方法可以進一步包括循環(huán)地重復去分化、培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、和再分化中的一個或多個的步驟，持續(xù)總計n個循環(huán)。在一些實施例中，對前一個緊鄰循環(huán)中再分化的再分化成熟脂肪細胞進行每個循環(huán)中去分化的步驟。在某些實施例中，n等于再分化的成熟脂肪細胞維持增殖的能力和/或維持合成和儲存脂肪的能力的循環(huán)次數(shù)。在一些實施例中，n等于再分化的成熟脂肪細胞增殖的能力和/或維持合成和儲存脂肪的能力下降不超過約例如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、或更多的循環(huán)次數(shù)，如由本領(lǐng)域技術(shù)人員針對其目標使用情況確定。

6、在特別實施例中，所述成熟脂肪細胞群體從脂肪細胞或包含脂肪組織的組織外植體獲得，即，通過從脂肪細胞或組織外植體中分離成熟脂肪細胞群體。分離成熟脂肪細胞群體的步驟可以包括將脂肪細胞或組織外植體添加到容器(即，細胞培養(yǎng)容器)中的消化緩沖液中。在某些實施例中，將脂肪細胞或組織外植體在消化緩沖液中孵育例如至少約30分鐘。在一些實施例中，在孵育后，將脂肪細胞和消化緩沖液離心以產(chǎn)生在消化緩沖液上方的第一漂浮脂肪細胞層(fal)和在容器底部的沉淀組織。在特別實施例中，將消化緩沖液和沉淀組織從容器中去除，并且將第一fal懸浮在生長培養(yǎng)基中。然后可以將第一fal和生長培養(yǎng)基離心以產(chǎn)生第二fal和第二沉淀組織。在一些實施例中，離心步驟在不過濾的情況下進行。在特別實施例中，將消化緩沖液和第二沉淀組織從容器中去除，并且將第二fal懸浮在生長培養(yǎng)基中，其中第二fal包含成熟脂肪細胞。

7、在特別實施例中，將脂肪細胞以約1克脂肪細胞或組織外植體/3ml消化緩沖液的濃度添加到消化緩沖液中。在一些實施例中，將脂肪細胞以約0.1、0.5、1.5、2、2.5、3克或更多克脂肪細胞或組織外植體/3ml消化緩沖液的濃度添加到消化緩沖液中。在特別實施例中，消化緩沖液包含膠原酶。在一些實施例中，消化緩沖液包含0.2％-1％膠原酶、至少0.2％膠原酶、或高達1％膠原酶。在特別實施例中，消化緩沖液包含衍生自微生物發(fā)酵的膠原酶。消化緩沖液中使用的膠原酶可以基于待消化的源細胞的種類來選擇。在一些實施例中，所述源細胞是哺乳動物細胞，并且所使用的膠原酶是膠原酶i、ii、或iv或具有與膠原酶iv相似的活性水平的膠原酶。在一些實施例中，所述源細胞是禽類細胞，并且所使用的膠原酶是膠原酶iv或具有與膠原酶iv相似的活性水平的膠原酶。重要的是，膠原酶iv可以在消化緩沖液中使用以消化哺乳動物細胞和/或禽類細胞。在特別實施例中，膠原酶包括膠原酶iv(例如，來自溶組織梭菌(clostridium?histolyticum)的膠原酶iv)及其具有相似酶活性的變體。在一些實施例中，消化緩沖液包含至少0.2％膠原酶iv。在一些實施例中，消化緩沖液包含高達1％的膠原酶iv。

8、在特別實施例中，組織外植體包含從受試者提取的皮下脂肪。所述受試者可以是例如哺乳動物、鳥類、魚類、爬行動物、甲殼綱動物、或兩棲動物。在一些實施例中，組織外植體包含從多個受試者提取的皮下脂肪。在一些實施例中，所述受試者是相同物種。在一些實施例中，所述受試者是不同物種。

9、在某些實施例中，脂肪細胞包含原代哺乳動物細胞、原代禽類細胞、原代魚類細胞、原代爬行動物細胞、原代甲殼綱動物細胞、原代兩棲動物細胞、或其組合。在一些實施例中，脂肪細胞不包含或不衍生自多能干細胞、胚胎干細胞、或未分化干細胞中的任何一種或多種。

10、在一些實施例中，將脂肪細胞去分化的步驟包括：i)將成熟脂肪細胞接種在去分化容器中，所述去分化容器具有足以完全填充所述容器的體積的生長培養(yǎng)基；ii)封閉所述去分化容器以產(chǎn)生缺氧環(huán)境；iii)將所述去分化容器倒置；iv)在所述倒置的去分化容器內(nèi)孵育細胞；v)允許成熟脂肪細胞粘附到去分化容器的頂板表面；以及vi)允許成熟脂肪細胞去分化為dfat細胞。在一些實施例中，將細胞在倒置的去分化容器中孵育約10天，或約3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14天或更長時間。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，如在此披露的接近10天的工藝效率是最有效的，但是對環(huán)境條件(諸如孵育溫度、溶解氣體等)的修改可以允許孵育時間處于極值或可能超過在此列出的起作用的那些孵育時間。在一些實施例中，將細胞在倒置的去分化容器中孵育數(shù)天，以足以觀察到伴隨中心脂質(zhì)積累損失的成纖維細胞形態(tài)。

11、在一些實施例中，將dfat細胞群體再分化，例如將第一靶生物質(zhì)內(nèi)的一個或多個傳代培養(yǎng)dfat細胞群體或dfat細胞群體再分化為成熟脂肪細胞的步驟包括使第一靶生物質(zhì)內(nèi)的一個或多個傳代培養(yǎng)dfat細胞群體或daft細胞與脂肪細胞分化促進劑(諸如胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-x補充劑、吲哚美辛、地塞米松、羅格列酮、生物素、泛酸鹽、pparγ激動劑、油酸鈉、麥胚凝集素、或其任何組合)接觸。

12、在一些實施例中，將第一靶生物質(zhì)內(nèi)的一個或多個傳代培養(yǎng)dfat細胞群體或dfat細胞再分化的步驟可以包括操縱一個或多個參數(shù)以優(yōu)先刺激再分化成熟脂肪細胞的形成。這樣的參數(shù)可以包括例如含有細胞的容器(即，培養(yǎng)容器)的內(nèi)表面的涂層的存在或性質(zhì)、培養(yǎng)環(huán)境的一種或多種機械特性(即，培養(yǎng)環(huán)境的彈性，如用例如水凝膠可控)、生長培養(yǎng)基密度、生長培養(yǎng)基滲透壓、生長培養(yǎng)基溫度、刺激dfat細胞增殖而非脂質(zhì)產(chǎn)生的因子、以及控制非脂肪細胞分化的劑。

13、在特別實施例中，在實現(xiàn)dfat細胞的至少約70％匯合度時達到第一靶生物質(zhì)。在一些實施例中，在實現(xiàn)至少約50％、60％、65％、75％、80％、85％、或更高的dfat細胞匯合度時達到第一靶生物質(zhì)。

14、在特別實施例中，如在本披露的各種方法中使用的生長培養(yǎng)基僅包含食品安全組分。在一些實施例中，生長培養(yǎng)基不含血清。在一些實施例中，生長培養(yǎng)基不包含胎牛血清或新生牛血清。在一些實施例中，生長培養(yǎng)基是基于植物的，例如，如出版物諸如yamanaka2023(其全部披露內(nèi)容通過援引并入本文)中所述的培養(yǎng)基，其中生長培養(yǎng)基是包含芥花油和/或其他生長因子的配制品。在一些實施例中，無動物產(chǎn)品的配制品從商業(yè)供應商獲得。

15、在一些實施例中，培養(yǎng)第一dfat細胞群體和/或傳代培養(yǎng)第一靶生物質(zhì)的步驟包括在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，直至分別達到第一靶生物質(zhì)或第二靶生物質(zhì)(即，培養(yǎng)容器中希望的匯合水平)。在一些實施例中，培養(yǎng)第一dfat細胞群體和/或傳代培養(yǎng)第一靶生物質(zhì)的步驟包括以至少5000-10,000個細胞/cm2的細胞濃度接種生長培養(yǎng)基并孵育，直至細胞達到至少70％匯合度。在一些實施例中，以至少例如2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000個細胞/cm2的濃度接種生長培養(yǎng)基，和/或孵育細胞，直至它們達到約50％、55％、60％、65％、75％、80％、或更高的匯合度。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，理論上比所呈現(xiàn)的更大或更低的值在技術(shù)上是可能的，但在標準單層細胞培養(yǎng)條件下可能是低效的。在一些實施例中，接種5000-10,000個細胞/cm2。在一些實施例中，接種1000-5000個細胞/cm2。在一些實施例中，接種10,000-12,000個細胞/cm2。

16、在另一方面，本披露提供了一種通過本文披露的各種方法中的任一種產(chǎn)生的脂肪產(chǎn)生細胞系。當脂肪產(chǎn)生細胞系是至少例如4個月大時，所述細胞系可以包含例如細胞內(nèi)體積的至少80％的總脂質(zhì)積累。在一些實施例中，脂肪產(chǎn)生細胞系包含使用本披露中提供的去分化方法產(chǎn)生的dfat細胞。

17、本披露的另外的方面包括通過本文披露的各種方法中的任一種產(chǎn)生的再分化的脂肪產(chǎn)生細胞的細胞系，其中所述細胞系被配置為在懸浮培養(yǎng)中存活。

18、另一方面包括一種用于食用的仿制肉類產(chǎn)品，其包含通過本文披露的任何方法產(chǎn)生的脂肪細胞，例如有效量的產(chǎn)生希望的風味和/或質(zhì)地特征的脂肪細胞，以及替代性肉類來源，例如有效量的替代性肉類來源。在一些實施例中，所產(chǎn)生的脂肪細胞占仿制肉類產(chǎn)品的總體積或重量的高達約5％(或總體積或重量的高達約1％、2％、3％、4％、6％、7％、8％、或更高)。在一些實施例中，替代性肉類來源占肉類產(chǎn)品的總體積或重量的至少約10％(或總體積或重量的至少約15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、或更高)。在某些實施例中，替代性肉類來源包括培養(yǎng)肉、植物性肉類替代品、昆蟲衍生的蛋白質(zhì)、發(fā)酵衍生的產(chǎn)品、真菌蛋白質(zhì)、或其組合。

19、在又另一方面，本披露涉及一種產(chǎn)生用于食用的仿制肉類產(chǎn)品的方法。在各種實施例中，所述方法包括i)將成熟脂肪細胞群體去分化以產(chǎn)生第一dfat細胞群體；ii)在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述第一dfat細胞群體，直至達到第一靶生物質(zhì)；iii)將所述第一靶生物質(zhì)傳代培養(yǎng)為一個或多個傳代培養(yǎng)dfat細胞群體；iv)將所述一個或多個傳代培養(yǎng)dfat細胞群體再分化為再分化的成熟脂肪細胞；以及v)將所述再分化的成熟脂肪細胞與有效量的替代性肉類來源組合以產(chǎn)生所述仿制肉類產(chǎn)品。在一些實施例中，將成熟脂肪細胞群體去分化以產(chǎn)生第一dfat細胞群體的步驟包括用膠原酶iv或與其具有相似酶活性的膠原酶消化所述成熟脂肪細胞群體。在某些實施例中，所述成熟脂肪細胞群體包含哺乳動物或禽類細胞中的至少一種。

20、本披露的另外的方面包括產(chǎn)生脂肪產(chǎn)生細胞系的體外方法，其中所述脂肪產(chǎn)生細胞系包含dfat細胞。在一些實施例中，所述方法包括將成熟脂肪細胞群體去分化以產(chǎn)生第一dfat細胞群體，其中此步驟包括用膠原酶iv或與其具有相似酶活性的膠原酶消化所述成熟脂肪細胞群體。所述方法可以進一步包括在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)第一dfat細胞群體，直至達到第一靶生物質(zhì)。在一些實施例中，所述生長培養(yǎng)基僅包含食品安全組分。在某些實施例中，所述方法包括將所述第一靶生物質(zhì)傳代培養(yǎng)為一個或多個傳代培養(yǎng)dfat細胞群體。所述方法可以進一步包括將所述一個或多個傳代培養(yǎng)dfat細胞群體再分化為再分化的成熟脂肪細胞。在某些實施例中，所述成熟脂肪細胞群體包含哺乳動物或禽類細胞中的至少一種。

21、在另一方面，本披露包括一種更新原代細胞的無轉(zhuǎn)導方法。在實施例中，所述方法包括i)將成熟脂肪細胞群體去分化以產(chǎn)生第一dfat細胞群體；ii)在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述第一dfat細胞群體，直至達到第一靶生物質(zhì)；iii)將所述第一靶生物質(zhì)傳代培養(yǎng)為一個或多個傳代培養(yǎng)dfat細胞群體；以及iv)將所述一個或多個傳代培養(yǎng)dfat細胞群體再分化為再分化的成熟脂肪細胞。在一些實施例中，將成熟脂肪細胞群體去分化以產(chǎn)生第一dfat細胞群體的步驟包括用膠原酶iv或與其具有相似酶活性的膠原酶消化所述成熟脂肪細胞群體。在某些實施例中，所述成熟脂肪細胞群體包含哺乳動物或禽類細胞中的至少一種。

22、本披露的一方面涉及一種減少由原代脂肪細胞組成的細胞系的衰老的方法。在各種實施例中，所述方法包括：i)將原代成熟脂肪細胞群體去分化以產(chǎn)生第一dfat細胞群體；ii)在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述第一dfat細胞群體，直至達到第一靶生物質(zhì)；iii)將所述第一靶生物質(zhì)傳代培養(yǎng)為一個或多個傳代培養(yǎng)dfat細胞群體；以及iv)將所述一個或多個傳代培養(yǎng)dfat細胞群體再分化為再分化的成熟脂肪細胞。在一些實施例中，將原代成熟脂肪細胞群體去分化以產(chǎn)生第一dfat細胞群體的步驟包括用膠原酶iv或與其具有相似酶活性的膠原酶消化所述原代成熟脂肪細胞群體。在某些實施例中，所述原代成熟脂肪細胞群體包含哺乳動物或禽類細胞中的至少一種。

23、本發(fā)明的另外的方面涉及一種用于產(chǎn)生可食用的培養(yǎng)動物脂肪的商業(yè)上可擴展的細胞系。所述細胞系可以包含通過本文披露的各種方法中的任一種產(chǎn)生的再分化的脂肪產(chǎn)生細胞。在一些實施例中，在商業(yè)規(guī)模的生物反應器中使用所述細胞系產(chǎn)生可食用的培養(yǎng)動物脂肪。

24、另外的方面包括一種產(chǎn)生至少兩個dfat細胞群體的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，可以容易地實現(xiàn)子細胞的克隆群體，并且可以將這些群體重新混合以產(chǎn)生源自單個活檢的異質(zhì)dfat細胞群體?？商娲?，可以將來自單個動物或兩個或更多個動物上的幾個活檢的大量或克隆dfat群體組合以產(chǎn)生異質(zhì)群體。在各種實施例中，所述方法包括獲得脂肪細胞或包含脂肪組織的組織外植體，以及從脂肪細胞或組織外植體中分離成熟脂肪細胞群體。在一些實施例中，分離成熟脂肪細胞群體的步驟包括：i)將脂肪細胞或組織外植體添加到容器中的消化緩沖液中，其中所述消化緩沖液包含膠原酶；ii)在所述消化緩沖液中孵育所述脂肪細胞或組織外植體，直至實現(xiàn)均質(zhì)消化(例如，持續(xù)至少約30分鐘)；iii)將所述脂肪細胞和消化緩沖液離心以產(chǎn)生在消化緩沖液上方的fal和在容器底部的沉淀組織，其中此離心步驟不包括過濾；iv)從所述容器中去除所述消化緩沖液和沉淀組織；v)將所述第一fal懸浮在生長培養(yǎng)基中；vi)將所述第一fal和生長培養(yǎng)基離心以產(chǎn)生第二fal和第二沉淀組織；vii)從所述容器中去除所述消化緩沖液和所述第二沉淀組織；以及viii)將所述第二fal懸浮在生長培養(yǎng)基中，其中所述第二fal包含成熟脂肪細胞。

25、在一些實施例中，所述方法進一步包括：ix)將成熟脂肪細胞接種在去分化容器中，所述去分化容器具有足以完全填充所述容器的體積的生長培養(yǎng)基；x)封閉所述去分化容器以產(chǎn)生缺氧環(huán)境；xi)將所述去分化容器倒置；xii)將所述倒置的去分化容器孵育約10天；xiii)允許成熟脂肪細胞粘附到去分化容器的頂板表面；以及xiv)允許成熟脂肪細胞去分化為至少兩個異質(zhì)dfat細胞群體。

26、從隨后的描述中，本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點將變得顯而易見。